[发明专利]一种携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体及构建方法和应用

摘要

本发明提供一种携带CTAG1B/NY‑ESO‑1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体，其构建方法，包括以下步骤：（1）体外克隆CTAG1B/NY‑ESO‑1基因；（2）将pscAAV‑MCS载体和克隆基因分别用限制性内切酶EcoR I和Xba I进行双酶切，然后DNA连接得携带CTAG1B基因的重组载体pscAAV‑CTAG1B；（3）测序鉴定。本发明所用肿瘤抗原基因有表达范围广、特异性高的特点；自补型重组腺相关病毒scAAV6有安全性高、侵染能力强的特点；基于pscAAV‑CTAG1B重组载体的细胞免疫治疗能有效缓解CTAG1B/NY‑ESO‑1抗原阳性肿瘤患者病情，且副作用小。

主权项

1.一种携带CTAG1B/NY‑ESO‑1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒，其特征在于，构建方法包括以下步骤：(1)体外克隆CTAG1B/NY‑ESO‑1基因；(2)将pscAAV‑MCS载体和CTAG1B/NY‑ESO‑1基因分别用限制性内切酶EcoR I和Xba I进行双酶切，然后进行DNA连接反应，得到携带CTAG1B基因的重组载体pscAAV‑CTAG1B；(3)测序鉴定；将所述携带CTAG1B基因的重组载体pscAAV‑CTAG1B与突变型辅助载体pAAV‑RC6^MUT和pHelper按摩尔比为1：1：1混合，共同用于CTAG1B/NY‑ESO‑1抗原阳性肿瘤的细胞免疫疗法；所述突变型辅助载体pAAV‑RC6^MUT的构建方法为：将野生型载体pAAV‑RC6上的四个位点T251，T492，S563和S663分步突变为缬氨酸，得到突变性辅助载体pAAV‑RC6^MUT；其中反应体系为含Mg²⁺的10xReaction buffer 5μL，10ng/μL Sample plasmid 2μL，10pmol/μL primer F 1μL，10pmol/μL primer R 1μL，浓度为2.5mM的dNTP mixture 2μL，1μL Muta‑direct Enzyme，38μL dH₂O；反应条件为：95℃预变性30秒，95℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸8分钟，共15个循环；最后4℃保存5分钟；点突变反应所用引物如下：T251V‑F：CCTTGCCCACCTATAACAGTCACCTCTACAAGCAAATC；T251V‑R：GATTTGCTTGTAGAGGTGACTGTTATAGGTGGGCAAGG；T492V‑F：CTAAAACAAAAACAGGTAACAACAACAGCAAC；T492V‑R：GTTGCTGTTGTTGTTACCTGTTTTTGTTTTAG；S563V‑F：TCACAGACGAAGAGGAAAGTAAAGCCACTAACCCCGTG；S563V‑R：CACGGGGTTAGTGGCTTTACTTTCCTCTTCGTCTGTGA；S663V‑F：CAGAGTTTTCGGCTACAAGTTTTGCTTCATTCATCACC；S663V‑R：GGTGATGAATGAAGCAAAACTTGTAGCCGAAAACTCT。