[发明专利]人脐带间充质干细胞与羊膜构建细胞移植片的方法

摘要

一种使用人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）和人源羊膜构建细胞移植片的方法，步骤如下：取新鲜采集的人羊膜和脐带，把羊膜分离绒毛膜，经生理盐水处理后冻存备用；将脐带剪成小段，撕取华通氏胶；将华通氏胶剪碎放置无菌培养皿上加入培养液，置于孵箱中培养，获得原代hUC-MSCs；向原代hUC-MSCs培养皿中加胰酶，经消化、孵箱中继续培养，即得hUC-MSCs；将冻存备用的羊膜无菌水化后平铺于羊膜载体套环上移入无菌培养皿中，将hUC-MSCs接种培养皿中，经孵箱中培养后，细胞融合度达80～90％即得细胞移植片。本发明制备的细胞片使其能够在特定部位进行损伤修复，弥补了单独使用hUC-MSCs或者羊膜治疗的不足，为一些难治性疾病提供了新的治疗策略，也为干细胞的临床应用开辟了新的治疗途径。

主权项

一种使用人脐带间充质干细胞和人源羊膜构建细胞移植片的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）取新鲜采集的人羊膜和脐带，清洗后将脐带放入生理盐水中浸泡备用；（2）羊膜处理：先将清洗干净的羊膜钝性分离掉绒毛膜，再使用生理盐水湿润纱布将羊膜擦拭干净，然后将羊膜浸泡入含青霉素50～200U/ml和硫酸链霉素50～200U/ml的生理盐水中浸泡0.5～1个小时后，放入无菌甘油中在2～8℃脱水，脱水时间不超过12小时，再转入无菌甘油中在‑20℃保存备用；（3）将步骤（1）浸泡好的脐带剪成1～2cm长度的小段，清洗，然后将脐带组织转移至培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处；将脐带一端沿静脉血管平行方向剪口，用组织镊沿切口方向静脉血管边缘纵向撕开，将1根静脉血管和两根动脉血管剖离，用组织镊去除羊膜，撕取华通氏胶，置于加有生理盐水的离心管中；（4）将华通氏胶，用生理盐水充分洗涤，然后剪碎至1～3 mm大小，将剪碎的组织块均匀放置到无菌培养皿上，铺平，沿培养皿边缘缓慢加入5～10ml培养液，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO孵箱中培养，每三天更换一次培养液，培养15～20天后，直至观察到皿底上形成多个大小不一、细胞数量密集的细胞岛时，则获得原代hUC‑MSCs；（5）将培养液完全移出，向原代hUC‑MSCs培养皿中加入质量百分比为0.05～0.25％的胰酶1～3ml，放入37℃培养箱中消化，当观察到贴壁细胞圆缩，且已经脱离瓶底后，加入5～10ml培养液终止消化，将悬液移至离心管中，离心弃上清，离心管中加入新培养液，反复吹打至其分散为单个细胞悬液，再把细胞悬液调节成4000～6000个细胞/㎝²体系接种于培养瓶中置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的孵箱中继续培养，每3～4天更换培养液一次，至融合度达80～90％，即得hUC‑MSCs，将细胞收获后冻存备用；（6）取步骤（2）中冻存的羊膜，放入无菌生理盐水中水化10～30分钟，将水化好的羊膜移至无菌培养皿中备用；（7）将步骤（6）制备的羊膜平铺于羊膜载体套环上，然后移入无菌培养皿中，放入37℃的CO孵箱中待用；（8）将冻存的hUC‑MSCs复苏，将细胞密度调节至4000～6000个细胞/㎝²体系接种于用步骤（6）的培养皿中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO孵箱中培养3～5天后，细胞融合度达80～90％即得细胞移植片。