[发明专利]人脐带间充质干细胞与羊膜构建细胞移植片的方法

权利要求书

1.一种使用人脐带间充质干细胞和人源羊膜构建细胞移植片的方法，其特征在于，包 括如下步骤：

（1）取新鲜采集的人羊膜和脐带，清洗后将脐带放入生理盐水中浸泡备用；

（2）羊膜处理：先将清洗干净的羊膜钝性分离掉绒毛膜，再使用生理盐水湿润纱布将羊 膜擦拭干净，然后将羊膜浸泡入含青霉素50～200U/ml和硫酸链霉素50～200U/ml的生理盐 水中浸泡0.5～1个小时后，放入无菌甘油中在2～8℃脱水，脱水时间不超过12小时，再转入 无菌甘油中在-20℃保存备用；

（3）将步骤（1）浸泡好的脐带剪成1～2cm长度的小段，清洗，然后将脐带组织转移至培 养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处；将脐带一端沿静脉血管平行方向剪 口，用组织镊沿切口方向静脉血管边缘纵向撕开，将1根静脉血管和两根动脉血管剖离，用 组织镊去除羊膜，撕取华通氏胶，置于加有生理盐水的离心管中；

（4）将华通氏胶，用生理盐水充分洗涤，然后剪碎至1～3mm大小，将剪碎的组织块均 匀放置到无菌培养皿上，铺平，沿培养皿边缘缓慢加入5～10ml培养液，置于37℃、饱和湿 度、体积分数为5％的CO孵箱中培养，每三天更换一次培养液，培养15～20天后，直至观察 到皿底上形成多个大小不一、细胞数量密集的细胞岛时，则获得原代hUC-MSCs；

（5）将培养液完全移出，向原代hUC-MSCs培养皿中加入质量百分比为0.05～0.25％的 胰酶1～3ml，放入37℃培养箱中消化，当观察到贴壁细胞圆缩，且已经脱离瓶底后，加入5～ 10ml培养液终止消化，将悬液移至离心管中，离心弃上清，离心管中加入新培养液，反复吹 打至其分散为单个细胞悬液，再把细胞悬液调节成4000～6000个细胞/㎝²体系接种于培养 瓶中置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的孵箱中继续培养，每3～4天更换培养液一次，至 融合度达80～90％，即得hUC-MSCs，将细胞收获后冻存备用；

（6）取步骤（2）中冻存的羊膜，放入无菌生理盐水中水化10～30分钟，将水化好的羊膜 移至无菌培养皿中备用；

（7）将步骤（6）制备的羊膜平铺于羊膜载体套环上，然后移入无菌培养皿中，放入37℃ 的CO孵箱中待用；

（8）将冻存的hUC-MSCs复苏，将细胞密度调节至4000～6000个细胞/㎝²体系接种于用步 骤（6）的培养皿中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO孵箱中培养3～5天后，细胞 融合度达80～90％即得细胞移植片。

2.根据权利要求1所述的一种使用人脐带间充质干细胞和人源羊膜构建细胞移植片的 方法，其特征在于：所述的步骤（1）中含青霉素50～200U/ml和硫酸链霉素50～200U/ml的生 理盐水是将注射用青霉素、硫酸链霉素按照浓度比1:1溶解入0.9％的氯化钠注射液中得到 的。

3.根据权利要求1所述的一种使用人脐带间充质干细胞和人源羊膜构建细胞移植片的 方法，其特征在于：所述的步骤（1）、（2）和步骤（3）中的清洗均为0.9％的氯化钠注射液清 洗。

4.根据权利要求1所述的一种使用人脐带间充质干细胞和人源羊膜构建细胞移植片的 方法，其特征在于：所述的步骤（4）中的培养液为购自Gibco公司DMEM/F12培养液加入10～ 20％的胎牛血清所得。