[发明专利]人脐带间充质干细胞与羊膜构建细胞移植片的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及人脐带间充质干细胞与羊膜构建细胞移植片 的方法。

背景技术

干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自我更新的细胞。干细胞治 疗是指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后输入（或植入）人体，用于疾病治疗的 过程。用于细胞治疗的干细胞主要包括成体干细胞、胚胎干细胞及诱导的多能性干细胞。目 前国内外已开展了多项干细胞临床应用研究，涉及多种干细胞类型及多种疾病类型。主要 疾病类型包括骨关节疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应（GVHD）、脊髓损伤及退行性神经系 统疾病、眼表疾病和糖尿病等。其中许多干细胞类型，是从骨髓、脂肪组织、脐带血、脐带或 胎盘组织来源的间充质干细胞，它们具有一定的多向分化潜能及抗炎和免疫调控能力等。

羊膜在一百多年前就作为一种敷料应用于外科，上世纪初作为一种供体材料应用于外 科皮肤移植手术中。羊膜是胎盘的最内层，光滑，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性。羊 膜具有减轻炎症程度、缩短炎症持续时间、抑制新生血管形成和抑制纤维化、减轻瘢痕形成 的功能。临床上利用羊膜具有促进上皮粘附生长及增殖、减轻炎症、抑制新生血管形成、减 少瘢痕增生、抗粘连等特性而把其应用于严重急性期或陈旧性眼表烧伤的治疗中去，获得 了很好的临床效果。

目前，干细胞的临床主要应用途径有静脉回输、病变部位注射、腰椎穿刺注射、导 管介入等，但是对于一些疾病，如角膜缘干细胞缺乏、骨关节疾病、子宫内膜黏连等需要干 细胞在特定位置发挥作用的时候，这些应用途径效果欠佳。临床治疗这些疾病时需要将干 细胞固定于病变部位使其发挥作用，而且固定干细胞的附着物需不产生排斥反应并能够自 行降解。本发明就是为解决这一问题而进行研究的。

发明内容

综上所述，为了克服现有技术问题的不足，本发明提供了一种使用人脐带间充质 干细胞与人源羊膜构建细胞移植片的方法。人脐带间充质干细胞英文名称是：hUC-MSCs，本 发明将人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）接种于羊膜上，使其能够在特定部位进行损伤修 复，弥补了单独使用hUC-MSCs或者羊膜治疗的不足，为一些难治性疾病提供了新的治疗策 略，也为干细胞的临床应用开辟了新的治疗途径。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种使用人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）和人源羊膜构建细胞移植片的方法，它包括 如下步骤：

（1）取新鲜采集的人羊膜和脐带，清洗后将脐带放入生理盐水中浸泡备用；

（2）羊膜处理：先将清洗干净的羊膜钝性分离掉绒毛膜，再使用生理盐水湿润纱布将羊 膜擦拭干净，然后将羊膜浸泡入含青霉素50～200U/ml和硫酸链霉素50～200U/ml的生理盐 水中浸泡0.5～1个小时后，放入无菌甘油中在2～8℃脱水，脱水时间不超过12小时，再转入 无菌甘油中在-20℃保存备用；

（3）将步骤（1）浸泡好的脐带剪成1～2cm长度的小段，清洗，然后将脐带组织转移至培 养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处；将脐带一端沿静脉血管平行方向剪 口，用组织镊沿切口方向静脉血管边缘纵向撕开，将1根静脉血管和两根动脉血管剖离，用 组织镊去除羊膜，撕取华通氏胶，置于加有生理盐水的离心管中；

（4）将华通氏胶，用生理盐水充分洗涤，然后剪碎至1～3mm大小，将剪碎的组织块均匀放置到无菌培养皿上，铺平，沿培养皿边缘缓慢加入5～10ml培养液，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO孵箱中培养，每三天更换一次培养液，培养15～20天后，直至观察到皿底上形成多个大小不一、细胞数量密集的细胞岛时，则获得原代hUC-MSCs；

（5）将培养液完全移出，向原代hUC-MSCs培养皿中加入质量百分比为0.05～0.25％的 胰酶1～3ml，放入37℃培养箱中消化，当观察到贴壁细胞圆缩，且已经脱离瓶底后，加入5～ 10ml培养液终止消化，将悬液移至离心管中，离心弃上清，离心管中加入新培养液，反复吹 打至其分散为单个细胞悬液，再把细胞悬液调节成4000～6000个细胞/㎝²体系接种于培养 瓶中置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的孵箱中继续培养，每3～4天更换培养液一次，至 融合度达80～90％，即得hUC-MSCs，将细胞收获后冻存备用；