[发明专利]一种卵巢原位注射实现RNA过表达的方法及应用

摘要

本发明公开了一种卵巢原位注射实现RNA过表达的方法及应用，属于生物技术领域。本发明通过体内转染的方法实现RNA在小鼠卵巢中的过表达，为进一步研究RNA在卵巢中的功能提供技术支持。本发明的方法避免了尾静脉过表达基因无靶向性的缺点；转染试剂的用量比尾静脉注射减少了几十倍，节约了实验成本；过表达效果很好，与空白对照组相比，RNA表达水平显著升高；本发明使用的微创的方法，对小鼠生存没有影响。

主权项

一种卵巢原位注射实现RNA过表达的方法，其特征在于：其操作步骤如下：(1)转染复合物配制，包括lncRNA重组载体稀释液和转染试剂稀释液：所述的lncRNA重组载体稀释液：1ug/ul的lncRNA重组载体：   6.25ul；10％葡萄糖溶液            3.125μl；水                        3.125μl；所述的转染试剂稀释液：转染试剂                  6.25μl；10％葡萄糖溶液            6.25μl；(2)体内转染实验操作步骤：a.小鼠麻醉与保定：手术前小鼠禁食12小时，用1ml注射器吸取0.3ml 1％的戊巴比妥钠，腹腔注射到小鼠体内，然后将其保定到置有四个长钉的木板上，拉伸四肢并绑到长钉上；b.用剃毛刀给小鼠腹部剃毛，暴露手术视野；c.无菌条件下，在肚脐与耻骨前缘中点向后沿腹底壁正中线切开皮肤2cm，切开腹白线及腹膜，打开腹腔；用眼科镊在切口下方找到子宫体右侧子宫角，沿子宫角向前找到右侧卵巢，用眼科镊轻轻固定住卵巢；d.将直径为1mm的硬玻璃毛细管在火焰上旋转灼烧，使其变软，迅速拉管从中间折断，使其内径变为200μm；然后将其连接到口吸管上，毛细管一端吸取25μl转染复合物之后轻柔地插入卵巢9～11mm，将步骤(1)中的转染复合物缓慢的吹入卵巢，作为实验组；e.用同样的方法找到左侧卵巢，将含有骨架载体的转染复合物缓慢的吹入卵巢，作为实验对照组；f.小心将卵巢还纳回原始解剖位置，利用可吸收缝合线分别缝合肌肉层和皮肤，缝合完毕后在手术切口缝合处用碘伏消毒，连续3天；g.术后白天用保温灯保温，夜晚关闭，恢复小鼠正常饮食；h.过表达效果检测；转染5天后，分别摘取两侧卵巢；在体视显微镜下分别切下两侧卵巢的一小部分，提取组织总RNA，反转录成cDNA，利用qPCR检测lncRNA的过表达水平。