[发明专利]豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品及其制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品及其制备方法。本发明根据串珠镰刀菌具有分类学意义的技术指标，解决了串珠镰刀菌实物标准样品溯源参照系与参照指标问题，并应用于本标准样品的定值分析中，在标准样品定性测试理论的研究成果基础上，在国家生物安全标准样品体系框架下，以来源明确的产毒真菌串珠镰刀菌模拟自然污染豆粉样品，采集对数生长期的串珠镰刀菌ACCC36127孢子污染无菌豆粉，混合仪拍打混合，分装，冻干制备出一种生物及产毒信息完整的串珠镰刀菌实物标准样品，获得具有真正溯源意义的串珠镰刀菌实物标准样品，是国内首次分类定级标准样品的研制，具有重要的意义。

主权项

1.一种豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品，其特征在于：所述豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品的溯源指标如下表所示：；所述产毒基因簇为FUM基因；所述豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品包含的序列为：内转录间隔区基因（ITS）序列：TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCAATTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGTACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA；核糖体rRNA 18S基因（18S）序列：GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTATACAGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCACTGGTGATTCATGATAACTCCTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTATTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAG；核糖体rRNA 28S基因（28S）序列：GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGTTTATGACCAGACTTGGGCTTGGTTAATCATCTGGGGTTCTCCCCAGTGCACTTTTCCAGTCCAGGCCAGCATCAGTTTTCCCCGGGGGATAAAGACTTCGGGAATGTGGCTCTCTTCGGGGAGTGTTATAGCCCGTTGTGTAATACCCTGGGGGGGACTGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAACGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTC；伏马菌素合成基因（FUM）序列：GTCCTACGCGATACATCCCACCACAATTGACCACTGCCTCCAACTCTTCTTCCCTGCTAGCTGTGACGGAATCTTTTACCGAGCCGAGAAACTATGCGTTCCAACAGCAATCGGACGCTTGTATCTTGCGGATGGGAAGCTGTGGGAGGTAGAGGGTGCCCGAGCTGAAGCATTGGCCGCGACAAACTCCGGGGGCTCGATTTCTGGGGCCGCTATCGTGGTGTCCCAACATGACTCTGTCCTGCTCTCTCTGGAGGATGGAAAATTCTCCCCACTGGAAATGGATCTTGGAGGGGAAGGAAACGCAGATTTGGTTGGTGCGGCACGTCTCGAATGGAAACCAAACTTGGACTTTGCCGATATGCATAGCCTTGTTCGCCCAAGTCATGGATCTATGAACGACGGCCCCGAGCTTGATC；所述豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品通过以下方法制备：第一步：培养串珠镰刀菌 ACCC36127 至对数生长期，采集孢子加入到10‑30 mL 的 0.5%的豆粉水溶液中，目标菌添加量约为 2×10⁵ CFU/mL；第二步：样品置于干净无菌袋中，混合仪拍打混合，再将混匀好的上述溶液加入到总体的豆粉水溶液中，重复混合步骤；第三步：将步骤二中制备好的菌液分装 0.5mL/瓶，放置橡胶盖，但不要塞紧，置于中试冻干机中低温真空冷冻干燥，制备成混合冻干粉；冷冻工艺参数如下：1）预冷阶段：隔板温度 5℃；2）冷冻阶段：设置隔板温度为 10℃，每个阶段降低 10℃，至‑50℃，每个温度阶段运行时间分别为 1h；3）主干燥阶段：隔板温度‑50℃，运行时间 0.5h，真空度 0.2mbar；隔板温度‑40℃，运行时间 7h，真空度 0.4mbar；隔板温度‑35℃，运行时间 7h，真空度 0.6mbar；隔板温度‑25℃，运行时间 5h，真空度 0.8mbar；隔板温度‑15℃，运行时间 4h，真空度 1.0mbar；隔板温度‑5℃，运行时间 2h，真空度 1.2mbar；4）二次干燥阶段：隔板温度 0℃，运行时间 3h，真空度 0.0010mbar； 隔板温度 15℃，运行时间 3h，真空度 0.0010mbar；隔板温度 25℃，运行时间 3h，真空度 0.0010mbar。