[发明专利]豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品及其制备方法

权利要求书

1.一种豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品，其特征在于：所述豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品的溯源指标如下表所示：

；

所述产毒基因簇为FUM基因；

所述豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品包含的序列为：

内转录间隔区基因（ITS）序列：TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCAATTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGTACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA；

核糖体rRNA 18S基因（18S）序列：GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTATACAGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCACTGGTGATTCATGATAACTCCTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTATTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAG；

核糖体rRNA 28S基因（28S）序列：

GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGTTTATGACCAGACTTGGGCTTGGTTAATCATCTGGGGTTCTCCCCAGTGCACTTTTCCAGTCCAGGCCAGCATCAGTTTTCCCCGGGGGATAAAGACTTCGGGAATGTGGCTCTCTTCGGGGAGTGTTATAGCCCGTTGTGTAATACCCTGGGGGGGACTGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAACGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTC；

伏马菌素合成基因（FUM）序列：

GTCCTACGCGATACATCCCACCACAATTGACCACTGCCTCCAACTCTTCTTCCCTGCTAGCTGTGACGGAATCTTTTACCGAGCCGAGAAACTATGCGTTCCAACAGCAATCGGACGCTTGTATCTTGCGGATGGGAAGCTGTGGGAGGTAGAGGGTGCCCGAGCTGAAGCATTGGCCGCGACAAACTCCGGGGGCTCGATTTCTGGGGCCGCTATCGTGGTGTCCCAACATGACTCTGTCCTGCTCTCTCTGGAGGATGGAAAATTCTCCCCACTGGAAATGGATCTTGGAGGGGAAGGAAACGCAGATTTGGTTGGTGCGGCACGTCTCGAATGGAAACCAAACTTGGACTTTGCCGATATGCATAGCCTTGTTCGCCCAAGTCATGGATCTATGAACGACGGCCCCGAGCTTGATC；

所述豆粉中串珠镰刀菌定性标准样品通过以下方法制备：

第一步：培养串珠镰刀菌 ACCC36127 至对数生长期，采集孢子加入到

10-30 mL 的 0.5%的豆粉水溶液中，目标菌添加量约为 2×10⁵ CFU/mL；

第二步：样品置于干净无菌袋中，混合仪拍打混合，再将混匀好的上述

溶液加入到总体的豆粉水溶液中，重复混合步骤；

第三步：将步骤二中制备好的菌液分装 0.5mL/瓶，放置橡胶盖，但不要

塞紧，置于中试冻干机中低温真空冷冻干燥，制备成混合冻干粉；

冷冻工艺参数如下：

1）预冷阶段：隔板温度 5℃；

2）冷冻阶段：设置隔板温度为 10℃，每个阶段降低 10℃，至-50℃，

每个温度阶段运行时间分别为 1h；

3）主干燥阶段：隔板温度-50℃，运行时间 0.5h，真空度 0.2mbar；隔

板温度-40℃，运行时间 7h，真空度 0.4mbar；隔板温度-35℃，运行时

间 7h，真空度 0.6mbar；隔板温度-25℃，运行时间 5h，真空度 0.8mbar；

隔板温度-15℃，运行时间 4h，真空度 1.0mbar；隔板温度-5℃，运行时

间 2h，真空度 1.2mbar；

4）二次干燥阶段：隔板温度 0℃，运行时间 3h，真空度 0.0010mbar； 隔

板温度 15℃，运行时间 3h，真空度 0.0010mbar；隔板温度 25℃，运行

时间 3h，真空度 0.0010mbar。