[发明专利]检测CD105、CD144、CD34、KDR、AnnexinV和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用

摘要

本发明涉及一种检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用，从循环系统中分别分离出EC‑MVs、EPC‑MVs、EC‑EXs和EPC‑EXs。该方法突破了以往用单特异性抗体的方法且提取出来的细胞MVs和EXs比现有技术的特异性和敏感性高。此外，本发明利用纳米微粒追踪分析术(NTS)针对细胞MVs和EXs进行特异性抗体micro‑beads方法结合荧光量子点(Q‑dots)方法进行检测。该方法能快速，准确，客观分析复杂样本例如血液中EC‑MVs,EPC‑MVs,EC‑EXs和EPC‑EXs的水平，有传统分析方法例如流式所不具备的优势。因此，本发明为进一步研究MVs和EXs作为疾病的生物标记物提供了特异和敏感的方法。

主权项

检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用，其特征在于：利用CD105和CD144作为ECs的分子标记，CD34和KDR作为EPCs的分子标记，Annexin V作为MVs的普遍标记,CD63作为EXs的普遍标记；所述检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡按以下步骤进行：(一)细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs的分离提取:a、抽取外周血液样品3‑10ml置于抗凝管保存；用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)稀释2－4倍，进行离心得到上清液血浆；b:对上清液血浆再次进行离心分离，沉淀物为MVs，c:对步骤b的上清液血浆进行超速离心分离，沉淀物为EXs；(二)对细胞膜微囊泡MVs和外泌体EXs进行特异性抗体标记及检测和分析有：a、EC‑MVs及EC‑EXs分选：1)用CD105和CD144作为ECs的分子标记，用PBS分别悬浮MVs和EXs，加入生物素偶联的anti‑human‑CD105抗体,4℃孵育24小时；2)将anti‑biotin偶联的磁珠分别加入悬浮后的MVs和EXs样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠后得到CD105+MV和CD105+EX悬浮液；3)将所得的CD105+MV和CD105+EX悬浮液分别加入biotin偶联的anti‑human‑CD144抗体,4℃孵育24小时；4)将anti‑biotin偶联的磁珠分别加入上述3)的样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠得到CD105+CD144+MV和CD105+CD144+EX悬浮液；5)将CD105+CD144+MV悬浮液20000r/min离心120min，所得沉淀即为CD105+CD144+MVs(EC‑MVs)，将CD105+CD144+EX悬浮液169000r/min超速离心6h,所得沉淀即为CD105+CD144+EXs(EC‑EXs)；6)利用常规质谱和RNAseq鉴定EC‑MVs和EC‑EXs所含的蛋白、mRNAs和miRNAs,利用常规蛋白质印迹和实时荧光定量PCR分析EC‑MVs和EC‑EXs中特定蛋白和RNA的表达；b、EPC‑MVs及EPC‑EXs分选：1)用CD34和KDR作为EPCs的分子标记，用PBS分别悬浮MVs和EXs，加入biotin偶联的anti‑human‑CD34抗体4℃孵育24小时；2)将anti‑biotin偶联的磁珠分别加入上述1)的悬浮MVs和EXs样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠后得到CD34+MV和CD34+EX悬浮液；3)将上述2)所得的CD34+MV和CD34+EX悬浮液分别加入biotin偶联的anti‑human‑KDR抗体，4℃孵育24小时；4)将anti‑biotin偶联的磁珠分别加入上述3)的样品中,置于磁性装置中24h，分别用磁珠分选缓冲液洗脱磁珠得到CD34+KDR+MV和CD34+KDR+EX悬浮液；5)将所得的CD34+KDR+MV悬浮液20000r/min离心120min，沉淀即为CD105+CD144+MVs(EPC‑MVs)，所得的CD34+KDR+EX悬浮液169000r/min超速离心6h,沉淀即为CD105+CD144+EXs(EPC‑EXs)；6)利用常规质谱和RNAseq鉴定EPC‑MVs和EPC‑EXs所含的蛋白、mRNAs、miRNAs；利用常规蛋白质印迹和实时荧光定量PCR分析EPC‑MVs和EPC‑EXs中特定蛋白和RNA的表达；c、EC‑MVs及EC‑EXs水平检测：1)用CD105和CD144作为ECs的分子标记，Annexin V作为MVs的普遍标记，CD105+MV及CD105+EX悬浮液的提取同上述EC‑MVs及EC‑EXs分选；2)将上述得到的CD105+MV及CD105+EX悬浮液分别与anti‑human‑CD144或者anti‑human‑Annexin V抗体4℃孵育24小时；再分别与量子点(Qdots)655标记的CD144或者Annexin V二抗,室温孵育90min；3)经过滤处理的PBS清洗后，所得的EC‑MVs和EC‑EXs进行NTA分析；采用NanoSight NS300分析仪在405nm激光器下进行检测,记录60s内EC‑MVs和EC‑EXs的平均大小和浓度；d、EPC‑MVs及EPC‑EXs水平检测：1)CD34和KDR作为EPCs的分子标记,CD63作为EXs的普遍标记，CD34+MV及CD34+EX悬浮液的提取同上述EPC‑MVs及EPC‑EXs分选；2)将上述得到的CD34+MV及CD34+EX悬浮液与anti‑human‑KDR或者anti‑human‑CD63抗体4℃孵育24小时；再分别与量子点(Qdots)655标记的KDR或者CD63二抗,室温孵育90min；3)经过滤处理的PBS清洗后，所得的EPC‑MVs及EPC‑EXs进行NTA分析；采用NanoSight NS300分析仪在405nm激光器下进行检测,记录60s内EPC‑MVs及EPC‑EXs的平均大小和浓度。