[发明专利]检测CD105、CD144、CD34、KDR、AnnexinV和CD63的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及检测CD105、CD144、CD34、KDR、Annexin V和CD63 的试剂在制备检测血液中的内皮及内皮祖细胞释放的细胞外囊泡的试剂中的应用，本方法具有目前最高的敏感性和特异性，属于医疗发明领域。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是细胞分泌释放的一类具有生物学活性的小囊泡。EVs可携带和传递母细胞的脂质，功能性蛋白质,信使RNAs(mRNAs)及微小RNAs(miRNAs)等物质进入靶细胞，调节靶细胞的基因表达和功能。由于技术水平和认识的限制，研究者最初提出EVs的概念时，仅仅把EVs当作是细胞的“垃圾袋”，让细胞摆脱一些无用蛋白垃圾。最近十多年的进一步研究发现，EVs所携带的“货物”具有重要的生物学意义，尤其是其所包含的miRNAs物质已经被证实会参与到疾病发生的过程。EVs可分为细胞膜微囊泡(microvesicles,MVs)和外泌体(Exosomes,EXs)两大类。二者的主要区别在于生成方式的不同。MVs是当细胞激活，损伤或者凋亡后直接从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为150nm-1000nm。 EXs是由细胞内的多泡小体与细胞膜融合后以外泌的形式释放到细胞外，直径约为40nm-150nm。此外，研究者也提出二者发挥的生物作用也可能不同。但由于目前缺乏有效的分离方法把二者分离出来，对它们的特性和功能做出准确的分析受到极大的限制。

内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)和血管内皮细胞(Endothelial Cells,ECs)是与血管系统直接相关的重要细胞，对于维持血管结构和功能的稳定，血管再生，组织修复和再生等具有重要的作用。已有研究证实，循环EPC水平下降和功能障碍与血管疾病的危险性高度相关。血管内皮细胞功能失调和损伤是导致血管病变的重要始动环节。临床研究发现，心血管疾病病人(包括动脉粥样硬化，脑卒中等)的循环内皮细胞(Circulating Endothelial cells,cECs)源的EVs(cEC-EVs)水平显著增高，并与治疗效果及疾病预后相关。与之相反的是，循环内皮祖细胞(Circulating Endothelial Progenitor Cells,cEPCs)源的EVs(cEPC-EVs)在血管疾病病人中的水平显著增高降低。这些研究表明CEC-EVs和 cEPC-EVs可作为潜在生物标记物用于疾病的预测，治疗效果的评估。最新研究发现EPC-EVs，通过携带某些与组织再生相关的蛋白，mRNAs 及miRNAs进入靶细胞调节基因表达和细胞功能，从而促进血管形成、骨骼肌再生、神经再生、减少心肌损伤、保护急性肾小管损伤、减少肺损伤等。因此，它们在血管损伤修复与再生过程中可能发挥着关键的作用。可是，传统方法很难在复杂样本中分选和检测特异性EVs，例如cEC-EVs和cEPC-EVs。因此，这方面的研究发展受到极大地限制。

目前检测EVs的方法有蛋白质印迹、流式分析、电镜和新型的纳米微粒追踪分析术(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)。蛋白质印迹主要用于测定EVs表面蛋白的表达。电镜可以直观检测到 EVs的粒径尺寸，但其方法繁琐，需要通过干燥、固定以及冷冻等不同方式进行前处理，这对生物样本的结构会造成一定的破坏，从而最终影响观察的效果。流式分析是目前最常用的检测EVs的方法，但由于传统流式细胞仪针对的样本主要是细胞，散射光的检测极限通常是 300nm左右，这就导致其无法探测到300nm以下的EVs。NTA是近年来新兴的纳米级别测量技术之一，通过观察溶液中的颗粒运动轨迹分析溶液中颗粒的布朗运动，使用斯托克斯-爱因斯坦方程，能够快速准确的检测出颗粒的数量分布其所具备的状态。更重要的是，NTA特有的荧光系统，为分辨特异性EVs提供了极为方便的平台。目前有四种荧光波长可供使用，分别为405nm、488nm、532nm和635nm，搭配相应的滤光片，实现荧光样品的测量，再由NTA技术对其进行单独检测，免受复杂样本(如血清、尿液等)环境的影响。我们采用免疫微磁珠(microbeads)结合特异性分子表面标记法达到分离和分辨不同种类EVs的目的。荧光NTA的出现为研究EVs提供了技术条件，但目前国内外并无利用NTA针对EVs进行免疫磁珠法结合特异性分子表面标记检测的报道，也没有相关的试剂盒。

发明内容