[发明专利]一种微藻胞内代谢物样品提取方法

摘要

本发明公开了一种微藻胞内代谢物样品提取方法，使用冰浴方式迅速失活胞内酶，通过二氯甲烷或者氯仿超声破碎，以二氯甲烷(或氯仿)：甲醇：水三相体系进行快速极性、非极性化合物、不溶性糖和蛋白的分离，用于后续代谢组学分析。本发明具有操作步骤少，可同时测定极性和非极性胞内组分的特点。

主权项

1.一种用于微藻代谢胞内代谢物样品制备的方法，其特征在于，具体操作如下：(1)冰浴失活胞内酶：将微藻液体培养基或与待处理微藻胞内渗透压相当的等渗溶液，于离心试管冷冻制备冰斜面；所使用的培养基或者等渗溶液体积为最多不超过离心试管体积的一半；取出离心试管，将待分析的微藻培养液直接加入到冰斜面上，体积不超过冰斜面所用溶液的体积；剧烈振荡直至离心试管内冰刚刚融化消失，得细胞悬液；(2)离心收集细胞：将(1)中的细胞悬液迅速转移至预冷的‑4至4℃离心机中，在2000～12000g转速下离心5～10分钟，收集细胞，弃上清；(3)细胞清洗：将收集的藻细胞用与待分析的微藻培养液体积相同的步骤(1)中制备冰斜面的溶液重悬后，按照步骤(2)条件离心收集细胞，弃上清，进行细胞清洗；其中，制备冰斜面的溶液需要预冷至‑4至4℃；重复该步操作1～3次；最终获得的细胞沉淀可以保存于‑80℃或者直接进行步骤(4)的操作；(4)超声破碎：按照每1x10⁸～3x10⁸个细胞加入2mL二氯甲烷和/或氯仿的比例，将二氯甲烷和/或氯仿加入到所收集的细胞沉淀中，在‑4至4℃冰水混合物中进行超声破碎，按照超声5～8s，停止5～15s间隔循环操作至溶液中无肉眼可见细胞聚集体；(5)萃取：对应于上述每加入2mL二氯甲烷和/或氯仿的步骤(4)体系，再加入1mL0～4℃预冷的甲醇水溶液，甲醇水溶液中甲醇和水的体积比1:3～1:5，体系中甲醇水溶液与二氯甲烷和/或氯仿溶液的体积比为1:2，充分混合，0～4℃静置5～10分钟至体系明显分层，4℃，12000g离心10分钟，获得三相分层体系，其中上层为水相，下层为有机相，中间固形物层；将上述三相分别取出，即可用于后续分析。