[发明专利]一种微藻胞内代谢物样品提取方法

说明书

本发明公开了一种微藻胞内代谢物样品提取方法，使用冰浴方式迅速失活胞内酶，通过二氯甲烷或者氯仿超声破碎，以二氯甲烷(或氯仿)：甲醇：水三相体系进行快速极性、非极性化合物、不溶性糖和蛋白的分离，用于后续代谢组学分析。本发明具有操作步骤少，可同时测定极性和非极性胞内组分的特点。

技术领域

本发明涉及一种微藻胞内代谢物样品提取方法。

背景技术

微藻为自养型微生物，因其细胞内存在光合作用系统也称为微藻植物。微藻具有高效吸收太阳能、固定二氧化碳产生生物质的能力(即光合作用能力)；同时微藻作为微生物的一种，其增殖速度较快。作为单细胞生物，微藻的主要组成为蛋白、脂肪、碳水化合物和核酸等。目前，微藻已经是重要的养殖饵料被养殖企业广泛应用，同时微藻也已经成为类胡萝卜素、蛋白质、多糖等保健食品的来源。随着化石能源枯竭的预期加剧，微藻在能源制品和精细化学品的潜在应用也得到了极大关注。为了有效利用微藻生物资源，或将微藻作为细胞工厂而定向调控微藻，微藻胞内代谢物分析都在其中起了重要作用。越来越多的研究表明，在代谢物研究过程中，样品提取方法对后期结果有很大的营养，一方面，胞内酶系的存在，有可能在样品处理过程中产生内源性转化，使得结果偏离预期，另一方面，不同极性和溶解性物质的存在，大多现有方法会丢失一部分样品，降低了样品的利用率，或操作复杂，耗时长(CN102472741B，CN103713075A，CN102495152B和CN102517349B)。

针对内源性降解，常用的方法包括低温失活、低温溶剂失活或高温溶剂失活几种。对于微藻来说，其培养体系为水环境，干基生物质质量含量通常在千分之几水平，因此现有方法是先离心再失活处理。尽管4℃离心时间仅有几分钟，但是该过程中细胞仍具有一定的活性。比较好的方法应先使胞内酶失活再进行生物质收集。离心收集的微藻生物质含水量在10-90％之间。

常规提取方法中，样品收集后会采用冷冻干燥进行水分的去除。但是无论是对极性物质的水提，还是利用有机溶剂进行抽提，通常提取剂的用量会远远高于离心收集到微藻细胞沉淀中的水量，后者对于大多数后续测定不产生实质影响。

同时，在常规提取方法中，多仅选择性收集其中一相进行后续分析，如果能够对多个组分进行分析，能够从有限的样品中获得更多的信息。

因此，本发明基于上述分析，针对微藻代谢物研究，尤其是组学层次研究特点，提出了一种新的胞内代谢物样品制备流程。

发明内容

本发明涉及一种用于微藻代谢胞内代谢物样品制备的方法，首先通过低温冰浴失活胞内酶，再离心收集细胞，并在二氯甲烷或者氯仿中超声破碎细胞，使用含有甲醇的水相进行代谢物分离，获得可溶的极性(水相)、非极性(溶剂相)和不溶的多糖及蛋白组分，用于后续的代谢组学研究。具体操作如下：

(1)冰浴失活胞内酶。将经过0.22微米滤膜过滤除菌的微藻培养基或与待处理微藻胞内渗透压相当的等渗溶液，于15mL或50mL离心试管中存放于-80℃冰箱中，制备冰斜面。所使用的培养基或者等渗溶液最多不超过离心试管体积的一半。将待分析的微藻培养液直接加入到冰斜面上，体积不超过冰斜面所用溶液的体积。剧烈振荡直至冰刚刚融化消失。

(2)离心收集细胞。将(1)中的细胞悬液迅速转移至遇冷的4℃离心机中，在2000～12000g转速下离心5～10分钟，收集细胞，弃上清。

(3)细胞清洗。将收集的藻细胞用与经过预冷至4℃的、取样时藻液体积相同的(1)中0.22微米滤膜过滤除菌的溶液重悬后，按照(2)条件离心收集细胞，弃上清。重复该步操作2～3次。最终获得的细胞沉淀可以保存于-80℃或者直接进行步骤(4)的操作。

(4)超声破碎。按照初始每2～8mg细胞加入2mL二氯甲烷或者氯仿的比例，加入到所收集的细胞沉淀中，在冰水混合物中进行超声破碎。以2mL上述体系为例，超声功率300-500w，按照超声5～8s，停止5～15s间隔循环操作至溶液中无肉眼可见细胞聚集体。