[发明专利]一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法

摘要

本发明提供一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法，在脐带获得、脐带运输、脐带制备和细胞培养过程中采取检测排查、添加抗生素等方法保证获得无污染的脐带间充质干细胞从而保障安全性，在分离、培养过程中采用改良的培养体系和培养方法提高分离效率，缩短培养周期并能获得高纯度、表征优良的细胞。本发明既可以有效降低成本又可以快速获得优质的间充质干细胞，减少对细胞的伤害，缩短了培养周期，减少污染，而且能够提高细胞纯度。

主权项

1.一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述方法包括如下：1）在无菌环境中，将脐带消毒后放在添加了储运液的储运瓶中，送往实验室进行分离制备；其中储运液为40ml的α‑MEM，并添加了庆大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml，两性霉素B 5ug/ml；运输温度为4‑25℃，运输时间不超过24小时；2）脐带瓶用酒精擦拭后放入生物安全柜中；3）在细胞培养皿中，使用洗涤液充分洗涤脐带3‑6次，将脐带两端各剪去1cm长度，丢弃；再洗涤脐带组织2‑4次；其中洗涤液为添加了100U/ml庆大霉素，50mg/ml青霉素，5ug/ml两性霉素B的医用生理盐水；4）将脐带剪成2cm长度的小段，清洗3次，转移脐带组织至新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处；去除静脉血管和动脉血管，撕取华通胶；华通胶置于加10ml洗涤液的50ml离心管中；5）华通胶用洗涤液充分洗涤3次，再用生理盐水洗涤2次，转移至新的50ml离心管中，充分剪碎至1mm3～3mm3大小；6）用去前段的10ml移液管将华通胶块平分到4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中，轻轻摇晃使其均匀分布于瓶底；其中，完全培养基为α‑MEM培养基中添加10wt.% FBS及如下细胞因子组合：EGF 5~10ng/ml + PDGF 5~10ng/ml + TNF‑α3~10 ng/ml + IFN‑γ 3~10 ng/ml；7）小心将培养瓶放入37℃、5%CO2培养箱中；培养最初7天，保持培养瓶绝对静止；8）第8天根据生长情况，用75%酒精消毒培养基瓶外壁，放置到生物安全柜内；9）用去头移液管吸弃旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；10）每瓶加消化液3ml，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min或室温孵育3min；待细胞变圆后每瓶加终止液10ml，快速震荡，用10ml移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml生理盐水，吹洗一次，汇入50ml离心管中；11） 1200rpm，离心6min，弃上清；合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数；12）根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为3~5×104/ml，标记，置37℃、5%CO2培养箱中培养；13）观察细胞，细胞生长至接近愈合时进行收获冻存；所述冻存的具体步骤为：1）配置终止液，消化前3min将消化液放置到37℃水浴锅中，把冻存母液平衡到4℃；2）将细胞培养瓶取出，用75%酒精消毒瓶底，放入生物安全柜内；3）用移液管吸弃旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；4）每瓶加入3ml 消化液，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液10ml/瓶，终止消化，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中；5） 1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测；6）加生理盐水至40ml，1200rpm，离心6min，取500μl上清做内毒素检测；7）将上清倒入洁净的离心管中，做菌检和支原体检测，离心沉淀用2.5ml FBS悬浮，再缓慢加入2.5ml冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml；冻存细胞数应5‑10×106/ml，如果细胞太少应增加传代；8）标记细胞代数、密度、条形码和操作时间于管壁外；9）将冻存管置于预先4℃处理的程序降温盒中，放置‑80℃对开门冰箱中24h，再将样本转入液氮罐中，记录储存位置。