[发明专利]一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法

说明书

本发明提供一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法，在脐带获得、脐带运输、脐带制备和细胞培养过程中采取检测排查、添加抗生素等方法保证获得无污染的脐带间充质干细胞从而保障安全性，在分离、培养过程中采用改良的培养体系和培养方法提高分离效率，缩短培养周期并能获得高纯度、表征优良的细胞。本发明既可以有效降低成本又可以快速获得优质的间充质干细胞，减少对细胞的伤害，缩短了培养周期，减少污染，而且能够提高细胞纯度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞。MSC具有免疫调节、促进造血恢复、能够修复损伤或病变的组织器官、具备多向分化潜能等功能,因此具有广泛的应用前景。

MSC最初在骨髓中被发现，目前我们已经可以从脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及胎盘、羊水、脐带中分离间充质干细胞。从脐带中分离间充质干细胞具有采集方便、易于保存和运输、对供体无伤害、易分离、纯度高、异体移植不会触发免疫反应等优点。

目前从脐带中分离间充质干细胞的方法有组织块贴壁法和酶消化法。酶消化法主要是采用胶原酶、胰蛋白酶、玻璃酸酶中的一种或者几种对剪碎的组织块进行消化，其有一个致命缺点是损伤细胞，影响细胞的表征和功能。组织块法虽然培养时间较长，但是其在细胞数量、 细胞形态、 免疫表型和分化潜能等方面均优于酶消化法。

目前现行的最接近的技术方案：用含青霉素和链霉素的PBS缓冲液将健康的新生儿脐带组织充分洗净，去除血污；将脐带剪成长度均匀的小段，进行机械法分离，钝性剥离华通胶，同时去除脐动脉和脐静脉；将剥离的华通胶均匀剪碎；用MSCs培养基重悬剪碎的华通胶，接种于明胶铺被的培养皿中，置于CO₂培养箱培养，待细胞生长融合至80%-90%时进行消化传代。

目前技术缺陷：现有技术是采用普通的培养基来进行脐带间充质干细胞的分离和培养，培养周期较长；并且没有提及相关检测手段，无法保证获得安全有效的细胞产品。

本发明既可以有效降低成本又可以快速获得优质的间充质干细胞，减少对细胞的伤害，缩短了培养周期，减少污染，而且能够提高细胞纯度。

发明内容

本发明提供一种从人脐带华通胶（Wharton’s Jelly）中分离脐带间充质干细胞并进行传代培养，最终获得细胞产品的方法，要解决脐带间充质干细胞分离、培养过程中可能出现的分离效率低、周期长、安全性不足等问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

在脐带获得、脐带运输、脐带制备和细胞培养过程中采取检测排查、添加抗生素等方法保证获得无污染的脐带间充质干细胞从而保障安全性，在分离、培养过程中采用改良的培养体系和培养方法提高分离效率，缩短培养周期并能获得高纯度、表征优良的细胞。

所述方法包括如下：

1）在无菌环境中，将脐带消毒后放在添加了储运液的储运瓶中，送往实验室进行分离制备；其中储运液为40ml的α-MEM,并添加了庆大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml,两性霉素B 5ug/ml；运输温度为4-25℃，运输时间不超过24小时；

2）脐带瓶用酒精擦拭后放入生物安全柜中；

3）在细胞培养皿中，使用洗涤液充分洗涤脐带3-6次，将脐带两端各剪去1cm长度，丢弃；再洗涤脐带组织2-4次；其中洗涤液为添加了100U/ml庆大霉素，50mg/ml青霉素,5ug/ml两性霉素B的医用生理盐水；