[发明专利]一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述方法包括如下：

1）在无菌环境中，将脐带消毒后放在添加了储运液的储运瓶中，送往实验室进行分离制备；其中储运液为40ml的α-MEM，并添加了庆大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml，两性霉素B5ug/ml；运输温度为4-25℃，运输时间不超过24小时；

2）脐带瓶用酒精擦拭后放入生物安全柜中；

3）在细胞培养皿中，使用洗涤液充分洗涤脐带3-6次，将脐带两端各剪去1cm长度，丢弃；再洗涤脐带组织2-4次；其中洗涤液为添加了100U/ml庆大霉素，50mg/ml青霉素，5ug/ml两性霉素B的医用生理盐水；

4）将脐带剪成2cm长度的小段，清洗3次，转移脐带组织至新的培养皿中，培养皿中加生理盐水至淹没脐带组织1/2处；去除静脉血管和动脉血管，撕取华通胶；华通胶置于加10ml洗涤液的50ml离心管中；

5）华通胶用洗涤液充分洗涤3次，再用生理盐水洗涤2次，转移至新的50ml离心管中，充分剪碎至1mm³～3mm³大小；

6）用去前段的10ml移液管将华通胶块平分到4瓶已加25ml完全培养基的175cm²培养瓶中，轻轻摇晃使其均匀分布于瓶底；其中，完全培养基为α-MEM培养基中添加10wt.% FBS及如下细胞因子组合：EGF 5~10ng/ml + PDGF 5~10ng/ml + TNF-α3~10 ng/ml + IFN-γ 3~10 ng/ml；

7）小心将培养瓶放入37℃、5%CO₂培养箱中；培养最初7天，保持培养瓶绝对静止；

8）第8天根据生长情况，用75%酒精消毒培养基瓶外壁，放置到生物安全柜内；

9）用去头移液管吸弃旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻震荡洗涤组织贴壁面，弃去，重复2次；

10）每瓶加消化液3ml，均匀浸润细胞贴壁面，37℃孵育1min或室温孵育3min；待细胞变圆后每瓶加终止液10ml，快速震荡，用10ml移液管吹打细胞贴壁面，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml生理盐水，吹洗一次，汇入50ml离心管中；

11） 1200rpm，离心6min，弃上清；合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数；

12）根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为3~5×10⁴/ml，标记，置37℃、5%CO₂培养箱中培养；

13）观察细胞，细胞生长至接近愈合时进行收获冻存；

所述冻存的具体步骤为：

1）配置终止液，消化前3min将消化液放置到37℃水浴锅中，把冻存母液平衡到4℃；

2）将细胞培养瓶取出，用75%酒精消毒瓶底，放入生物安全柜内；

3）用移液管吸弃旧培养基，更换移液管，于非细胞培养面加入10ml生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；

4）每瓶加入3ml 消化液，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液10ml/瓶，终止消化，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中；

5） 1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测；

6）加生理盐水至40ml，1200rpm，离心6min，取500μl上清做内毒素检测；

7）将上清倒入洁净的离心管中，做菌检和支原体检测，离心沉淀用2.5ml FBS悬浮，再缓慢加入2.5ml冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml；冻存细胞数应5-10×10⁶/ml，如果细胞太少应增加传代；

8）标记细胞代数、密度、条形码和操作时间于管壁外；

9）将冻存管置于预先4℃处理的程序降温盒中，放置-80℃对开门冰箱中24h，再将样本转入液氮罐中，记录储存位置。

2.根据权利要求1所述的一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述的细胞因子组合：EGF 6ng/ml + PDGF7ng/ml + TNF-α5ng/ml + IFN-γ 5ng/ml。

3.根据权利要求1所述的一种获得安全、有效的脐带间充质干细胞的方法，其特征在于：所述的消化液含0.25wt.%胰酶、0.03wt.%EDTA。