[发明专利]一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种ClfA‑A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，提取金黄色葡萄球菌DNA，根据GenBank上已提交的ClfA基因序列，分别设计上游引物与下游引物，且向上游引物与下游引物中分别引入Bam H I和Hind III酶切位点，制得重组质粒pET‑ClfA‑A；进行PCR扩增，将重组质粒pET‑ClfA‑A转入感受态细胞BL21(DE3)中，用IPTG进行诱导，对目的蛋白进行大量表达和纯化；取家兔，免疫后采血获取血清，进行检测；经过免疫程序后采血获取血清，测定抗体效价后，制得金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。本发明建立的有效的金黄色葡萄球菌凝集因子蛋白(ClfA‑A)的制备，为以ClfA‑A为靶位的疫苗研究，对金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据。

主权项

一种ClfA‑A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：1)重组质粒pET‑ClfA‑A的构建提取金黄色葡萄球菌DNA，根据GenBank上已提交的ClfA基因序列，分别设计上游引物与下游引物，且向上游引物与下游引物中分别引入Bam H I和Hind III酶切位点，制得重组质粒pET‑ClfA‑A；上游引物P1序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物P2序列如SEQ ID NO：2所示，然后对重组质粒pET‑ClfA‑A进行PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；经蓝白斑筛选及双酶切鉴定得到的阳性克隆进行序列测定分析；2)诱导的表达产物将上述重组质粒pET‑ClfA‑A转入感受态细胞BL21(DE3)中，用终浓度为0.8‑1.2mM的IPTG进行诱导，取不同时间段的表达产物进行SDS‑PAGE检测；3)目的蛋白的大量表达及纯化根据SDS‑PAGE检测确定的最佳诱导时间和IPTG的浓度，对目的蛋白进行大量表达和纯化；4)免疫动物的筛选选取体重2～2.5kg家兔，免疫后采血获取血清，进行检测；5)免疫程序：首次免疫：目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后免疫家兔，每只家兔注射650‑750μg上述目的蛋白，背部皮下多点注射；首次免疫后每隔15d加强免疫一次，以弗氏不完全佐剂为佐剂，每只家兔250‑350μg目的蛋白，第3次免疫后第10d采血获取血清，测定抗体效价后，制得金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。