[发明专利]一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物基因技术领域，具体是一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法。

背景技术

奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是奶牛的常见疾病，是奶牛乳腺组织的炎症，主要为乳腺组织感染病原微生物所致，是奶牛的常见病、多发病。几十年来，国内外针对奶牛乳房炎的防治作了很多努力，但该病一直是困扰我国奶牛业养殖发展最为严重的疾病之一。它使奶牛泌乳和生殖机能受到损伤，不仅降低奶牛的产奶量，使奶牛淘汰，影响乳的品质造成严重的经济损失，严重时甚至影响到人类健康。

S.aμreus感染的第一步就是在宿主体内定植，而实现定植的前提是细菌在宿主的组织和细胞表面的黏附，细菌有可以黏附到组织表面的组分成为黏附素，S.aureus黏附素有纤维蛋白原凝集素A、B(Fibronectin-binding proteins clumping factor A and B，ClfA，ClfB)，纤维蛋白A、B(Fibronectin-binding protein A and B，FnBPA，FnBPB)，胶原结合蛋白(collagen-binding protein Can)和A蛋白(protein A)，ClfA是金黄色葡萄球菌主要的黏附素之一，能够介导金黄色葡萄球菌结合于细胞表面的纤维素连接蛋白原，使细菌黏附于宿主细胞表面，促进细胞对寄主组织的入侵。ClfA是将细菌黏附到纤维蛋白和可溶及不溶性纤维蛋白原上的决定性因子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，由以下步骤组成：

1)重组质粒pET-ClfA-A的构建

提取金黄色葡萄球菌DNA，根据GenBank上已提交的ClfA基因序列，分别设计上游引 物与下游引物，且向上游引物与下游引物中分别引入Bam HI和Hind III酶切位点，制得重组质粒pET-ClfA-A；

上游引物P1序列如SEQ ID NO：1所示，

下游引物P2序列如SEQ ID NO：2所示，

然后对重组质粒pET-ClfA-A进行PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；经蓝白斑筛选及双酶切鉴定得到的阳性克隆进行序列测定分析；

2)诱导的表达产物

将上述重组质粒pET-ClfA-A转入感受态细胞BL21(DE3)中，用终浓度为0.8-1.2mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)进行诱导，取不同时间段的表达产物进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测；

3)目的蛋白的大量表达及纯化

根据SDS-PAGE检测确定的最佳诱导时间和IPTG的浓度，对目的蛋白进行大量表达和纯化；

4)免疫动物的筛选

选取体重2～2.5kg家兔，免疫后采血获取血清，进行检测；

5)免疫程序：

首次免疫：目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后免疫家兔，每只家兔注射650-750μg上述目的蛋白，背部皮下多点注射；

首次免疫后每隔15d加强免疫一次，以弗氏不完全佐剂为佐剂，每只家兔250-350μg目的蛋白，第3次免疫后第10d采血获取血清，测定抗体效价后，制得金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。

作为本发明进一步的方案：PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s、62℃45s、72℃1min30s，35个循环；72℃10min。

作为本发明进一步的方案：步骤2)中IPTG的终浓度为1.0mM。

作为本发明进一步的方案：首次免疫：目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后免疫家兔，每 只家兔注射700μg目的蛋白。

作为本发明进一步的方案：首次免疫后每隔15d加强免疫一次，以弗氏不完全佐剂为佐剂，每只家兔300μg目的蛋白。

根据上述方法制得金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明建立的有效的金黄色葡萄球菌凝集因子蛋白(ClfA-A)的制备，为以ClfA-A为靶位的疫苗研究，对金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据。

附图说明