[发明专利]Jurkat-KI-R5细胞系及其构建方法和应用

摘要

本发明涉及一种Jurkat‑KI‑R5及其构建方法和应用，本发明将强有力的增强子/启动子组合(CAG)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术同源重组敲入到CD4+Jurkat T细胞的CCR5基因的启动子区，基因修饰的细胞系命名为Jurkat‑KI‑R5细胞。本发明所述Jurkat‑KI‑R5细胞CAG启动子的精确重组到CCR5启动子指定位置，导致CCR5稳定地高表达。和母系Jurkat细胞相反，Jurkat‑KI‑R5细胞极易被HIV‑1感染。所以，Jurkat‑KI‑R5细胞提供了一个艾滋病研究急需的细胞平台。

主权项

一种Jurkat‑KI‑R5细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A.得到培养中的Jurkat细胞；B.构建pU6‑CCR5‑gRNA载体：用BbsI限制性内切酶对pU6‑gRNA载体进行酶切，回收；插入DNA双链，所述DNA双链由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3经退火而成；经感受态细胞转化、提取质粒，得到pU6‑CCR5‑gRNA载体；C.构建修复模板DNA载体，该修复模板DNA载体5’端至3’端依次包括有CCR5基因上游同源臂，LoxP位点，CAG启动子，抗性筛选基因Puro‑IRES‑Neo，LoxP位点，CAG启动子，CCR5基因下游同源臂；D.将线性化的修复模板DNA载体、pU6‑CCR5‑gRNA质粒和能表达hCas9的质粒共转染进入Jurkat细胞中，转染后加入培养液令细胞恢复生长，随后加入含有嘌呤霉素的培养基中培养，筛选分离出单克隆，得到Jurkat‑KI‑R5细胞系。