[发明专利]Jurkat-KI-R5细胞系及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种Jurkat‑KI‑R5及其构建方法和应用，本发明将强有力的增强子/启动子组合(CAG)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术同源重组敲入到CD4+Jurkat T细胞的CCR5基因的启动子区，基因修饰的细胞系命名为Jurkat‑KI‑R5细胞。本发明所述Jurkat‑KI‑R5细胞CAG启动子的精确重组到CCR5启动子指定位置，导致CCR5稳定地高表达。和母系Jurkat细胞相反，Jurkat‑KI‑R5细胞极易被HIV‑1感染。所以，Jurkat‑KI‑R5细胞提供了一个艾滋病研究急需的细胞平台。

技术领域

本发明涉及生物技术，具体是涉及Jurkat-KI-R5细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

尽管抗逆转录病毒疗法防治艾滋病毒在过去几十年的发展作出巨大努力，艾滋病仍然是全球最重要的传染病之一。根据联合国艾滋病规划署报告，2013年艾滋病全球流行，艾滋病毒携带者的预计数量从1990年的8.1百万上升到2012年的35.3百万。此外，药物抗性HIV病毒株最近已报道。因此，开发新的治疗方法用于清除病人体内的艾滋病病毒是十分重要的治疗手段。能无限增殖的HIV宿主细胞系对于艾滋病研究和治疗的发展是非常重要的。

HIV主要以体内巨噬细胞和CD4+T细胞为靶标。另外，CCR5和CXCR4辅助受体是HIV感染T细胞所必需的。因此，建立稳定表达HIV-1辅助受体CCR5的CD4+T细胞将对HIV研究非常有用。然而，现有的细胞系要么低表达CCR5而不支持R5HIV-1感染，或者不能从随意整合到基因组中的转基因CCR5表达载体稳定表达CCR5。因此，HIV研究中的一个瓶颈问题是缺乏同时稳定表达CD4及CCR5的T细胞系。即使先前建立的CCR5转基因T细胞系，因为表达载体随机整合到基因组中，而导致转基因的不稳定表达。所以，建立新的人类高表达内源性CCR5基因的CD4+T细胞系，对研发治疗HIV的新策略有重要作用。

发明内容

基于此，本发明的目的之一提供一种构建Jurkat-KI-R5细胞系的方法，构建得到的Jurkat-KI-R5细胞系可高水平表达CCR5。

实现上述目的的技术方案如下。

一种Jurkat-KI-R5细胞系的建立方法，包括以下步骤：

A.培养Jurkat细胞；

B.构建pU6-CCR5-gRNA载体：用BbsI限制性内切酶对pU6-gRNA载体进行酶切，回收；插入DNA双链，所述DNA双链由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3经退火成，经感受态细胞转化、提取质粒，得到pU6-CCR5-gRNA载体；

C.修复模板DNA载体的构建，该修复模板DNA载体5’端至3’端依次包括有CCR5基因上游同源臂，LoxP位点，CAG启动子，抗性筛选基因Puro-IRES-Neo，LoxP位点，CAG启动子，CCR5基因下游同源臂；

D.将线性化的修复模板DNA载体、pU6-CCR5-gRNA质粒和能表达hCas9的质粒共转染进入Jurkat细胞，转染后加入培养液令细胞恢复生长，随后加入含有嘌呤霉素的培养基培养，筛选分离出单克隆，得到Jurkat-KI-R5细胞系。

在其中一个实施例中，所述修复模板DNA载体的序列如SEQ ID NO.4所示。

在其中一个实施例中，电转染的参数为：0.4cm电击杯，250volt，975μF，细胞数量为5x10⁵-5x10⁶，DNA质量为1.8-2.2μg。

在其中一个实施例中，所述能表达hCas9的质粒为pCAG-hCas9质粒。

在其中一个实施例中，培养基中的嘌呤霉素浓度为1.5-2.0μg/ml。