[发明专利]Jurkat-KI-R5细胞系及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种Jurkat-KI-R5细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

得到培养中的Jurkat细胞；

构建pU6-CCR5-gRNA载体：用BbsI限制性内切酶对pU6-gRNA载体进行酶切，回收；插入DNA双链，所述DNA双链由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3经退火而成；经感受态细胞转化、提取质粒，得到pU6-CCR5-gRNA载体；

构建修复模板DNA载体，该修复模板DNA载体5’端至3’端依次包括有CCR5基因上游同源臂，LoxP位点，CAG启动子，抗性筛选基因Puro-IRES-Neo，LoxP位点， CAG启动子， CCR5基因下游同源臂；

将线性化的修复模板DNA载体、pU6-CCR5-gRNA质粒和能表达hCas9的质粒共转染进入Jurkat细胞中，转染后加入培养液令细胞恢复生长，随后加入含有嘌呤霉素的培养基中培养，筛选分离出单克隆，得到Jurkat-KI-R5细胞系；

所述修复模板DNA载体的序列如SEQ ID NO.4所示；所述能表达hCas9的质粒为pCAG-hCas9质粒。

2.根据权利要求1所述的Jurkat-KI-R5细胞系的构建方法，其特征在于，培养基中的嘌呤霉素浓度为1.5-2.0 μg /ml。

3.根据权利要求1所述的Jurkat-KI-R5细胞系的构建方法，其特征在于，所述转染为电转染，所述电转染的参数为：0.4cm电击杯，250 volt，975 μF，细胞数量为5x10⁵-5x10⁶，DNA质量为1.8-2.2μg。

4.根据权利要求1-3任一项所述构建方法得到的Jurkat-KI-R5细胞系。

5.权利要求4所述Jurkat-KI-R5细胞系在研发艾滋病治疗药物中的非诊断、非治疗目的应用。

6.权利要求4所述Jurkat-KI-R5细胞系作为研发艾滋病治疗的平台的非诊断、非治疗目的应用。