[发明专利]一种pAPN基因定点修饰猪

摘要

本发明公开了一种pAPN基因定点修饰猪，其采用基因工程的方法构建猪氨肽酶N(porcine aminopeptidase N，pAPN)的基因载体；通过细胞转染等多种技术获得pAPN基因定点修饰猪。本发明主要有两点应用：1、从遗传的角度根除猪病毒性腹泻和K88的感染，减少养猪的疫病控制成本，减少其对环境的污染，为健康养殖和减少抗生素的滥用提供一种方法；2、该定点修饰猪为研究人类癌症等相关疾病的发病机制及相关干预与治疗的筛选与临床前预试。

主权项

一种pAPN基因定点修饰猪，包括以下步骤：(1)pAPN基因的克隆与序列分析利用pAPN的基因组和cDNA序列信息，设计引物进行克隆，利用高保真DNA聚合酶扩增目的片段，克隆至表达载体后，进行测序，对其基因组序列和cDNA序列进行分析，检测其变异位点；(2)pAPN基因编辑载体的构建与活性分析及Donor载体的构建①pAPN基因编辑载体的构建：利用pAPN基因组序列信息及变异位点分析数据，选取其第一外显子为靶序列，设计2对TALE蛋白识别序列，分别克隆至pTALEN‑01载体中；②pAPN基因Donor载体的构建：为提高载体的构建效率，本载体在构建过程中采用一步定向克隆法进行克隆，首先将合成的两对同向LoxP克隆入pDonor‑TN01载体中；然后针对2对TALE蛋白识别序列设计左右同源臂，利用高保真酶对同源臂进行扩增；使用一步定向克隆法将左右同源臂和LoxP和筛选标记克隆入载体，形成最终的porcine aminopeptidase N基因的Donor载体，命名为pDonor‑001；③靶点活性验证：将构建的若干对pAPN TALEN质粒、及实验室保存的CMV‑PG03‑Stop和GLuc donor载体共转染至293T细胞中，转染48h后，收集细胞上清液，使用Secrete‑Pair^TM双荧光素酶报告系统分析TALEN对的活性；(3)pAPN基因定点修饰ST细胞系的建立与TGEV致病性研究④pAPN基因定点修饰ST细胞系的建立：培养细胞待ST细胞生长至80％汇合时，消化细胞使用电转染法进行转染，TALEN左臂质粒：右臂质粒：Donor质粒按照一定的比列进行转染，48h后观察绿色荧光的比例以确定转染效率，消化后进行培养，加入终浓度为1.6μg/mL的puromycin进行筛选，为提高阳性率以高浓度持续筛选10天后，使得培养皿中的克隆数不多于5个，且克隆之间距离较大生长状态良好，挑选单克隆进行扩增，得到的转基因细胞扩增并进行一系列的鉴定；pAPN重组左臂扩增大小为1177bp，上游引物：AGAAGGGAAGGATTTTGAGGTTC，下游引物：ACTTATATACGGTTCTCCCCCA，pAPN重组右臂扩增大小为1455bp，上游引物：TCAGAAGCTATCTGGTCTCCCT，下游引物：TCACCTTTGGGCGGCATATT；PCR扩增目的基因片段，并进行测序验证；⑤ST定点修饰细胞的攻毒：利用上述获得的pAPN基因定点修饰ST细胞和对照组ST细胞将等量的TGEV病毒感染细胞，共同孵育6h后，PBS洗涤3次，将一部分细胞提取RNA后，反转录成cDNA，使用荧光定量PCR检测其表达；通过以上手段评估pAPN基因定点修饰ST细胞的抗病毒效果；评估后发现敲除细胞具有明显的抗病毒作用；(4)pAPN基因定点修饰成纤维转基因细胞系的建立与重构胚的获取⑥pAPN基因定点修饰成纤维细胞系的建立：方法同步骤(3)中④；⑦重构胚的获取：将从屠宰场摘取的猪卵巢运回实验室，抽取卵巢上3‑6mm直径的卵泡，挑选胞质均匀，包裹完整并且带有2层以上卵丘细胞的卵母细胞复合体后，转入到成熟培养滴中培养42±2h后，进行脱卵丘，挑选排出第一极体且卵周隙明显的卵母细胞；用盲吸法去核后，进行核移植，操作完成后将重构胚转移到石蜡油覆盖好的T2液滴中，38.5℃恒温培养30min，将T2中已恢复好的重构卵在化学辅助激活液中激活10min，然后融合，将融合的重构胚置于PZM3中进行培养；(5)pAPN基因定点修饰猪的获得与鉴定选用发情良好、体型较好的母猪为受体，将重构1天后的胚胎移植到自然发情后1天的母猪输卵管中，调整饲养管理，直至克隆猪出生；获得定点修饰的猪。