[发明专利]一种pAPN基因定点修饰猪

说明书

技术领域

本发明涉及动物基因工程技术领域，尤其涉及一种pAPN基因定点修饰猪。

背景技术

1、仔猪腹泻病带来的损失巨大

仔猪腹泻病是集约化养猪生产条件下一种常发的、典型的由多因素导致的 疾病。近年来，我国仔猪腹泻病发病率与死亡率居高不下，不少猪场的死亡率 几乎是100％，造成了极大地经济损失。据不完全统计，2014年我国存栏母猪 约4500万头，年产仔猪近8亿头，但最后上市的猪大约只有80％，猪在不同 阶段的死亡率达20％，其中约有一半是由于腹泻病导致的。因此，仔猪腹泻病 对养猪业来说危害极大。

2、仔猪腹泻病病原

猪腹泻病病原种类繁多，致病性复杂，有细菌性的、病毒性的及寄生虫等， 其中，由病毒和大肠杆菌感染仔猪而引起的腹泻呈现为高发病率和高死亡率。 就病毒性腹泻而言，目前认为猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritisvirus，TGEV)和猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrheavirus，PEDV)是致使初生仔猪和断奶仔猪发生腹泻最常见和最重要 的病毒。猪传染性胃肠炎病毒是引起仔猪腹泻的重要病原之一，尤其是对1-2 周龄仔猪致死率可达100％(Renetal2008)。病毒性腹泻造成的损失也极其 严重，2010冬至2012年初，病毒性腹泻给全国各地规模猪场造成了很高的发 病率和死亡率，仅在南方就有超过100万头仔猪死于腹泻(Sunetal2012)。 而对于细菌性腹泻，K88和F18大肠杆菌是导致初生仔猪和断奶仔猪腹泻最常 见和最重要的细菌性病原菌。但是，该病的防治主要以抗生素为主，但是效果 极差，加之抗生素的滥用对食品卫生健康造成的危害较大。因此，培育一种抗 仔猪腹泻病的猪对于防控仔猪腹泻病，保障养猪业健康发展具有重要意义。

3、猪APN的功能和作用

病毒猪胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)同属于I型冠状 病毒。目前，大多数冠状病毒成员的细胞表面受体已被鉴定出并呈现一定规律 性。在I型冠状病毒中，大多数病毒的受体为氨肽酶N(aminopeptidaseN， APN)；II型冠状病毒受体为以9-O-乙酰唾液酸；而SARS-CoV的功能性受体是 血管紧张素转移酶(ACE2)。

1963年，Pfleiderer和Celliers从猪的肾脏中分离得到猪氨肽酶 N(Pfleiderer&Celliers1963)，1989年根据cDNA克隆序列对比确定了APN 即为细胞表面的促分化抗原CD13。CD13/APN的酶活性表现为从小肽段N端切 除氨基酸，故又名氨肽酶N。猪氨肽酶N是含有Zn²⁺的膜结合型外肽酶，属于 依赖锌离子的金属蛋白酶M1家族，pAPN基因cDNA全长2892bp，含有20个外 显子，编码964个氨基酸，分子量约为150kDa，广泛存在于多种组织和细胞 中，尤其在小肠黏膜上高效表达，该蛋白通过近N端的螺旋产生跨膜作用进入 细胞膜，使pAPN能够固定在细胞上，且有一部分N端肽链的单个氨基能够通 过催化作用进入细胞浆，从而发挥其功能。由于pAPN基因具有重要的作用， 其晶体结构也已被解析出来(Chenetal2012)，但是其作用的基因调控网络 未见有报道。

免疫学和体外研究表明pAPN是TGEV和PEDV等病毒的主要受体，宿主pAPN 表达量的高低在一定程度上决定了病毒感染程度的强弱(Delmasetal1994, Delmasetal1992,Delmasetal1993,Lietal2007,Nam&Lee2010, 李宝贤etal2009)。TGEV感染过程中病毒S蛋白与受体pAPN发生特异性结 合的位置是pAPN上第717-813位氨基酸(Bridgenetal1993)。PEDV感染过 程中病毒S蛋白与受体pAPN发生特异性结合的位置是pAPN上第500-963位氨 基酸(单智夫2012)。