[发明专利]一种通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法

摘要

本发明公开了一种通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法，是以绒毛白蜡成熟种子胚的胚根为外植体，在MS盐分+B5有机+2mg·L–16‑苄基腺嘌呤(BA)+0.1mg·L–1萘乙酸(NAA)+30g·L–1glucose+5.0g·L–1agar的诱导培养基和MS盐分+B5有机+30g·L–1glucose+5.0g·L–1agar萌发培养基上诱导出体细胞胚并获得再生植株。实验证实体胚诱导率为59.8％，体胚萌发率高达81.2％，本发明方法为绒毛白蜡转基因育种工程、优良无性系工厂化育苗和种质资源保护等提供和建立了成熟稳定的技术体系。

主权项

一种通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法，步骤是：(1)选取颗粒饱满的种子剥除外种皮后置于三角瓶中，流水冲洗2–3小时，用75％乙醇浸泡1分钟，再用0.1％的升汞消毒8–10分钟，无菌水冲洗4–5次后，将消毒后的种子在超净工作台上接种到MS种子萌发培养基上，萌发2–6天；(2)取萌发的胚根为外植体，接种在体细胞胚诱导培养基上，暗培养后，获得胚性愈伤组织；其中：所述暗培养是指在培养瓶上覆盖黑布，于昼温度25±2℃，夜温度18±2℃条件下，培养18–22天；(3)将暗培养后的胚性愈伤组织转移到体胚萌发培养基上，进行光照培养，诱导出体胚苗；(4)将体胚苗转移到试管苗复壮培养基，光照培养10–14天后，转入生根培养基继续光照培养；(5)将步骤(4)获得的生根植株炼苗，移栽；上述种子萌发、体胚诱导培养、体胚萌发培养、试管苗复壮、生根培养各阶段光照培养的条件为：14小时光照/10小时黑暗，光密度为100–120μmol·m‑2·s‑1；其特征在于：步骤(2)中所述的体细胞胚诱导培养基配方为：MS盐分+B5有机+1.8–2.2mg·L–1 6‑苄基腺嘌呤(BA)+0.08–0.12mg·L–1萘乙酸(NAA)+30g·L–1葡萄糖+5.0g·L–1琼脂，pH值5.2–5.4；步骤(3)中所述的体胚萌发培养基为MS盐分+B5有机+30g·L–1葡萄糖+5.0g·L–1琼脂，pH值5.7–5.9；其中，上述MS盐分+B5有机的组分为：KNO3 1900mg·L‑1，NH4NO3 1650mg·L‑1，MgSO4·7H2O 370mg·L‑1，KH2PO4 170mg·L‑1，CaCl2·2H2O 440mg·L‑1，MnSO4·4H2O 22.3mg·L‑1，ZnSO4·7H2O 8.6mg·L‑1，H3BO3 6.2mg·L‑1，KI 0.83mg·L‑1，NaMoO4·2H2O 0.25mg·L‑1，CuSO4·5H2O 0.025mg·L‑1，CoCl2·6H2O 0.025mg·L‑1，Na2‑EDTA 37.3mg·L‑1，FeSO4·7H2O 27.8mg·L‑1，维生素B110mg·L‑1，维生素B61mg·L‑1，叶酸0.5mg·L‑1，肌醇100mg·L‑1，甘氨酸2.0mg·L‑1；步骤(4)中所述试管苗复壮培养基配方为：WPM培养基+0.5mg·L–1 6‑BA+0.2mg·L–1ZT+0.01mg·L–1NAA+30mg·L–1葡萄糖(glucose)+5.0g·L–1琼脂(agar)，pH值5.8；步骤(4)中所述生根培养基配方为：1/2MS培养基+1.0mg·L–1IBA+0.05 mg·L–1NAA+20mg·L–1葡萄糖(glucose)+5.0g·L–1琼脂(agar)，pH值5.8。