[发明专利]一种通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法

权利要求书

1.一种通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法，步骤是：

(1)选取颗粒饱满的种子剥除外种皮后置于三角瓶中，流水冲洗2–3小时，用75％乙醇浸泡1分钟，再用0.1％的升汞消毒8–10分钟，无菌水冲洗4–5次后，将消毒后的种子在超净工作台上接种到MS种子萌发培养基上，萌发2–6天；

(2)取萌发的胚根为外植体，接种在体细胞胚诱导培养基上，暗培养后，获得胚性愈伤组织；

其中：所述暗培养是指在培养瓶上覆盖黑布，于昼温度25±2℃，夜温度18±2℃条件下，培养18–22天；

(3)将暗培养后的胚性愈伤组织转移到体胚萌发培养基上，进行光照培养，诱导出体胚苗；

(4)将体胚苗转移到试管苗复壮培养基，光照培养10–14天后，转入生根培养基继续光照培养；

(5)将步骤(4)获得的生根植株炼苗，移栽；

上述种子萌发、体胚诱导培养、体胚萌发培养、试管苗复壮、生根培养各阶段光照培养的条件为：14小时光照/10小时黑暗，光密度为100–120μmol·m^-2·s^-1；

其特征在于：

步骤(2)中所述的体细胞胚诱导培养基配方为：MS盐分+B₅有机+1.8–2.2mg·L^–1 6-苄基腺嘌呤(BA)+0.08–0.12mg·L^–1萘乙酸(NAA)+30g·L^–1葡萄糖+5.0g·L^–1琼脂，pH值5.2–5.4；

步骤(3)中所述的体胚萌发培养基为MS盐分+B₅有机+30g·L^–1葡萄糖+5.0g·L^–1琼脂，pH值5.7–5.9；

其中，上述MS盐分+B₅有机的组分为：KNO₃ 1900mg·L^-1，NH₄NO₃ 1650mg·L^-1，MgSO₄·7H₂O 370mg·L^-1，KH₂PO₄ 170mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O 440mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.3mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg·L^-1，H₃BO₃ 6.2mg·L^-1，KI 0.83mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.025mg·L^-1，Na₂-EDTA 37.3mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1，维生素B₁10mg·L^-1，维生素B₆1mg·L^-1，叶酸0.5mg·L^-1，肌醇100mg·L^-1，甘氨酸2.0mg·L^-1；

步骤(4)中所述试管苗复壮培养基配方为：WPM培养基+0.5mg·L^–1 6-BA+0.2mg·L^–1ZT+0.01mg·L^–1NAA+30mg·L^–1葡萄糖(glucose)+5.0g·L^–1琼脂(agar)，pH值5.8；

步骤(4)中所述生根培养基配方为：1/2MS培养基+1.0mg·L^–1IBA+0.05 mg·L^–1NAA+20mg·L^–1葡萄糖(glucose)+5.0g·L^–1琼脂(agar)，pH值5.8。

2.根据权利要求1所述通过绒毛白蜡体胚诱导获得再生植株的方法，其特征在于：步骤(2)所述的体细胞胚诱导培养基配方为：MS盐分+B₅有机+2.0mg·L^–1 6-苄基腺嘌呤(BA)+0.1mg·L^–1萘乙酸(NAA)+30g·L^–1葡萄糖+5.0g·L^–1琼脂，pH值5.4。