[发明专利]一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法

摘要

本发明涉及一种多顺反子质粒型逆转录病毒载体及其构建方法，属于基因工程领域。通过基因重组方法获得：将融合雌激素受体的重组酶基因、猿猴病毒大T抗原基因、人端粒酶基因和融合胸苷激酶的增强绿色荧光蛋白基因五个顺反子插入到逆转录病毒载体中得到重组质粒。与现有技术相比，使用本发明质粒型逆转录病毒载体建立的永生化细胞系可在他莫昔芬药物处理之后获得非转化正常细胞，同时利用胸苷激酶自杀基因机理在更昔洛韦药物处理后可使未回复的细胞自杀，从而获得完全非转化正常细胞。本发明保证了重组逆转录病毒载体的生物安全性，具有促进该多顺反子选择性的高表达和利于后续筛选阳性细胞群以及检测多顺反子的表达的优点。

主权项

一种质粒型逆转录病毒载体pCSHNET，其特征在于：该载体包含有五个如SEQ ID NO：1‑5所示核苷酸序列的多顺反子基因以及一个逆转录病毒系统；SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的融合雌激素受体的重组酶Cre‑er基因；SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的猿猴病毒大T抗原SV40LT基因；SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的人端粒酶hTERT基因；SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的新霉素耐药NeoR基因；和SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的融合胸苷激酶的增强绿色荧光蛋白EGFP‑TK基因；其中：所述的逆转录病毒系统为一种口蹄疫病毒自剪肽FMDV‑2A的短肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6‑9所示。