[发明专利]一种立克次体液相基因芯片的检测方法

摘要

本发明公开一种立克次体液相基因芯片的检测方法，涉及基因芯片检测领域,是一种快速、准确、高通量的病原检测技术。采用多重PCR结合液相芯片技术，通过液相芯片技术对多重PCR扩增的产物进行检测，克服了多重PCR产物电泳检测不能区分分子量相近片段的缺点，极大地提高了引物设计自由度，使同一反应管中进行数对甚至数十对引物的PCR反应成为可能。液相芯片技术检测过程采用生物素-亲和素放大系统连接荧光报告分子，且芯片荧光检测器对反应信号进行了放大，检测灵敏度得到极大提高，该技术可在我国疾控、卫生检疫等部门推广应用，从而提供一种快速、准确、高效的检测手段，为保障人民健康，应对突发公共卫生事件，保护公共安全等方面发挥重要作用。

主权项

一种立克次体液相基因芯片的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)PCR反应：①设计引物，分别选择Q热立克次体特有的转座酶htpAB基因相关重复序列、普氏立克次体枸橼酸合成酶gltA基因和莫氏立克次体枸橼酸合成酶gltA基因设计引物，通过引物设计软件分析各引物退火温度值以及各引物间二聚体的形成；②PCR体系及反应条件，PCR体系（50μL）包括PCR预混液25μL，上下游引物（10μM）各1.0μL，DNA 3μL，去离子水补足50μL；反应条件：94℃预变性5分钟，94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，35个循环,最后72℃延伸5分钟；(2)制备、杂交和检测微球，每条探针的5’端连上 20个多聚碱基T作为连接端，并氨基化修饰；① 联结探针与羧化微球，其步骤如下：A、将已分装好的碳化二亚胺粉末从‑20℃取出，回温至室温；B、将氨基化修饰的寡核苷酸探针重悬于蒸馏水中使其终浓度为1mmol/L；C、将1mL包装中的小球振荡 30秒，超声30秒，至小球分散；D、取100μL小球至 1.5mL 离心管，14000g 4分钟，小心吸出上清；E、微球重悬于50μL pH 4.5、0.1 mol/L的 2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸溶液中，振荡20秒，超声20秒；F、用蒸馏水将1mmol/L的寡核苷酸探针10倍稀释；G、将2μL 10倍稀释的探针加于小球悬浮液中，振荡混匀；H、配制10mg/mL 碳化二亚胺溶液；I、每个1.5ml 离心管中加入 2.5μL新鲜配制的 碳化二亚胺溶液，振荡混匀；J、置涡流振荡器上，室温避光孵育30分钟；K、每管中加入2.5μL新鲜配制的 碳化二亚胺溶液，振荡混匀；L、再次置涡流振荡器上，室温避光孵育30分钟；M、反应结束后，14000g离心 4分钟，小心吸弃上清；N、各管中加入1mL 0.02% 吐温20洗涤 1 次；O、离心14000g 4分钟，小心吸弃上清；P、各管中加入1mL 0.1% 的十二烷基硫酸钠溶液，洗涤1次，同上离心吸弃上清；Q、各管中加入100μL pH8.0的TE缓冲液，振荡10s，超声10s，使微球重悬；R、微球的计数：用血球计数板计数；S、联结好探针的微球悬于pH8.0的TE缓冲液中，4℃保存备用；② 联结微球的质控，其步骤如下：A、合成与探针互补的寡核苷酸链,寡核苷酸链5’端生物素标记；B、用涡流振荡器充分振荡已经联结好的编码微球；C、吸取适量微球，用2×氯化四甲铵杂交液稀释至3500个/25μL，置于0.2μL离心管中；D、稀释与探针互补的寡核苷酸链至 0.1μmol/L；E、各管中加入10μL上述寡核苷酸溶液以及15μL TE缓冲液溶液使其终体积为50μL，吹打混匀；F、95℃变性10分钟；G、55℃杂交15分钟；H、转移至滤板抽滤去掉未结合的核苷酸链；I、各孔加75μl4ng/μL 链亲和素‑藻红蛋白的1×氯化四甲铵杂交液液，室温避光孵育10分钟，抽滤去掉未结合的链亲和素‑藻红蛋白；J、各孔加入75μL1×氯化四甲铵杂交液溶液，振荡使微球重悬；K、反应结束后使用液相悬浮芯片仪检测；L、同时设置不加寡核苷酸链而只加TE缓冲液的阴性对照，同上进行检测；结果判定：联结的微球的MFI值大于5000，说明包被成功；③ 杂交与检测，其步骤如下：A、取联结好探针的微球各3500个混于25μL 2×氯化四甲铵杂交液杂交液中，置于0.2μL离心管中；B、各管中加10μL混合模板的PCR产物和 15μL TE缓冲液溶液，使其终体积为50μL，吹打混匀；C、 95℃变性10分钟；D、杂交温度下杂交一定时间；E、转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物；F、各孔加75μL 4ng/μL 链亲和素‑藻红蛋白的1×氯化四甲铵杂交液液，室温避光孵育10分钟，抽滤去掉未结合的链亲和素‑藻红蛋白；G、各孔加入75μL 1×氯化四甲铵杂交液溶液，振荡使微球重悬，结束后使用液相悬浮芯片仪检测；H、按操作说明，先冲洗管道，再预热激光检测器30分钟，待机备用；I、根据微球编号和待检因子，编写检测用的控件；J、根据样本的数量，建立操作流程；K、然后将96孔板放入检测仓检测；检测时，同时以PCR阴性对照进行杂交检测作为检测本底，对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的平均荧光强度值，即为MFI值，亦即读取的这种编号的微球群的每个微球信号强度的统计平均值，通过液相悬浮芯片仪悬浮芯片系统读取各孔MFI值以及本底荧光值，本底荧光值即为BFI值，结合液相悬浮芯片仪分析处理数据；当待检测样本的MFI值为本次检测背景信号强度三倍以上时，即判为阳性；(3)建立多重引物液相基因芯片检测体系：混合分别联结有3种特异性探针的 3种微球组成多重检测系统；(4)检测PCR 产物：在多重检测体系中每孔加入25μL含有微球各3500个的2×氯化四甲铵杂交液杂交液、10μL PCR产物和15μL TE缓冲液溶液；(5)对制备、杂交和检测微球中的杂交条件进行优化:优化杂交温度，杂交温度分别选择 47℃、51℃、55℃、59℃、63℃ 5个温度进行，以混合模板的PCR产物为被检测物，以MFI值与BFI值之比进行结果判断；优化杂交时间，确定杂交温度后，以混合模板的PCR产物为被检测物，杂交时间分别取10分钟、15分钟、20分钟、25分钟，比较不同杂交时间对信号强度的影响；(6)液相基因芯片的方法学验证：①特异性验证，选用多种菌株，考核多重悬浮芯片方法对样品检测的特异性；②灵敏度验证，不同浓度的质粒分别按照优化后的PCR体系进行扩增，然后用包被对应探针的微球进行检测，液相悬浮芯片仪系统自带软件进行分析得出剂量反应曲线；BFI值为阴性对照检测时的信号，最低检测限从拟合曲线上推定，即分析物的MFI值相当于BFI值三倍所对应的检测物浓度；③重复性验证，以质粒为模板，PCR扩增后，使用同一批包被探针的微球，对同一批PCR产物进行重复性检测；④模拟标本验证，以不携带立克次体的鼠体标本作为实验模板，将添加质粒的鼠体标本和不加质粒的鼠体标本作为对照，同时提取 DNA进行检测。