[发明专利]PTEN基因干扰慢病毒载体及其制备方法

摘要

本发明提供一种PTEN基因干扰慢病毒载体及其制备方法，涉及基因工程技术领域，制备了PTEN基因干扰慢病毒载体，分别将4个siRNA干扰片断，通过酶切位点与载体连接后，通过PCR产物凝胶电泳鉴别挑选阳性克隆测序,还与pHelper 1.0、pHelper2.0两种包装质粒共转染293T细胞培养，获得重组慢病毒载体后，转染目的细胞，再利用Real-time PCR，对4个PTEN基因干扰载体质粒对目的基因干扰效果进行了检测，结果显示，四个靶点对Hela细胞内PTEN基因的表达都有显著下调作用，相对NC组，目的基因的表达水平下调达到85％，为进一步大量扩增提取病毒奠定了基础。

主权项

一种PTEN基因干扰慢病毒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、利用Age I和EcoR I酶切消化pGCSIL‑GFP质粒，凝胶电泳回收酶切线性化后的载体质粒，将4个siRNA干扰片断分别与切线性化后的载体质粒pGCSIL‑GFP连接，再用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取180‑200μl转移到无菌的微量离心管中，4只离心管分别加2‑4μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟；S2、将步骤S1中处理后的4只离心管放到预加温到40‑45℃的循环水浴中放好的试管架上，静静放置90秒后快速将离心管转移到冰浴中，冷却l‑2分钟；S3、向上述4支离心管中分别加800μl SOC培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将离心管转移到37℃摇床上，温育42‑46分钟使细菌复苏，再将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和Amp抗性的LB琼脂培养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养，16小时；S4、将4个siRNA干扰片断连接pGCSIL‑GFP质粒的PCR产物分别通过凝胶电泳鉴别阳性克隆和阴性克隆，并挑选阳性克隆测序。