[发明专利]基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及试剂盒

摘要

为了克服现有方法及试剂盒的不足,本发明提供了一种基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒，属于基因突变检测领域。本发明通过在EGFR基因片段扩增体系中引入耐热DNA连接酶和针对突变位点处的特定连接引物组，可以基于扩增片段条带直接判定野生型样本或使得低突变含量样品其最终的PCR产物中突变片段的比例高于50%；然后通过变性和退火，制备在突变位点处含有错配构造的DNA片段杂交样品，从而利用错配切除酶实现对杂合基因片段样品的有效检测。本发明方法及试剂盒可以基于酶切检测出样本中含量低至1%的EGFR基因突变，准确率极高，检测时间较短且费用低廉，适合于临床检测。

主权项

1.基于酶切检测人类 EGFR 基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括10×PCR缓冲液、10×耐热 DNA 连接酶缓冲液、dNTPs、8条扩增引物、9 条连接引物、耐热 DNA 连接酶、DNA 聚合酶、10×错配切除酶缓冲液和错配切除酶 ；所述8 条扩增引物其序列如SEQ.ID NO.1‑SEQ.ID NO.8所示，其中SEQ.ID NO.1和SEQ.ID NO.2、SEQ.ID NO.3 和SEQ. ID NO.4、SEQ.ID NO.5 和 SEQ.ID NO.6、SEQ.ID NO.7 和SEQ.ID NO.8 分别用于靶向第18、 19、20、21 号外显子片段的扩增；所述 9 条连接引物其核苷酸序列如 SEQ.ID NO.9‑ SEQ.ID NO.17 所示，所述连接引物其5’端第一个核苷酸均进行磷酸化修饰，其中SEQ.ID NO.9 靶向 第18号外显子的3 种突变位点，SEQ.ID NO.10 靶向第19号外显子的19种突变位点，SEQ. ID NO.11‑SEQ.ID NO.15 靶向第20号外显子的5种突变位点，SEQ.ID NO.16‑SEQ.ID NO.17 靶向第21号外显子的2 种突变位点；所述错配切除酶为T7核酸内切酶I或芹菜Cel I 酶，酶活单位不低于500 单位/mL。