[发明专利]一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法

摘要

本发明涉及一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法，具体涉及纤维素酶蛋白基因密码子优化及其与透明颤菌血红蛋白(VHb)共表达毕赤酵母体系的构建。本发明利用Gene Designer(DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)软件对EG II(GenBank Accession No.DQ178347.1)核苷酸序列进行密码子偏向性优化，构建了pPIC9K-eg2表达载体，并以Pichiapastoris GS115为宿主通过电转化获得重组毕赤酵母菌株。另外，从NCBI中获得VHb(GenBank Accession No.M30794.1)核苷酸序列，通过人工合成基因后构建了pPICZαA-vgb表达载体，以含EG II基因重组毕赤酵母菌株作为宿主，通过电转化获得共表达毕赤酵母菌株。通过检测表明，共表达菌株在菌浓生长与酶活方面均有提高，其中OD₆₀₀值提高7.2％，酶活提高2.2％。

主权项

一种毕赤酵母中共表达血红蛋白VHb和纤维素酶蛋白的构建方法，其特征在于如下步骤：1)密码子偏向性优化：本发明利用软件Gene Designer实现对SEQ ID NO.1所示的EG II核苷酸序列密码子偏向性优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2)pPIC9K‑eg2表达载体构建：以质粒pPIC9K为载体，将优化后的EG II基因插入启动子AOX1下游，5’端酶切位点为EcoR I，3’端酶切位点为Not I，构建pPIC9K‑eg2表达载体。3)获取重组菌株：以Sac I作为pPIC9K‑eg2表达载体线性化位点，实现表达载体线性化，通过电转化转入毕赤酵母。4)获得vgb基因：从NCBI中获取透明颤菌血红蛋白基因，在5’端添加EcoR I酶切位点，3’端添加Not I酶切位点，通过人工合成获得目的基因。5)pPICZαA‑vgb表达载体构建：以质粒pPICZαA作为载体，将vgb基因插入启动子AOX1下游，5’端酶切位点为EcoR I，3’端酶切位点为Not I，构建pPICZαA‑vgb表达载体。6)通过高浓度遗传霉素G‑418与博来霉素双抗性筛选得到高拷贝共表达菌株。7)比较EG II重组菌株与EG II和VHb共表达菌株的产酶水平。