[发明专利]利用枸杞茉莉酸代谢途径重要酶基因提高植物抗逆性的方法

摘要

本发明涉及一种利用枸杞茉莉酸代谢途径重要酶基因提高植物抗逆性的方法。枸杞茉莉酸生物合成途径丙二烯氧化物合酶基因LmAOS、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、和OPDA还原酶基因选自以下核苷酸序列之一：1)具有SEQ ID No.1/2/3序列所示的核苷酸序列；通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，通过3'RACE技术克隆枸杞丙二烯氧化物合酶基因LmAOS、丙二烯氧化物环化酶基因LmAOC、和OPDA还原酶基因LmOPR，得到完整的编码基因序列分别为为1533bp、744bp、1203bp。构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300‑LmAOS、pCAMBIA2300‑LmAOC、pCAMBIA2300‑LmOPR，电击法将载体转入农杆菌C58细胞，用这种细胞转化拟南芥，得到转基因拟南芥，用于后续有关抗逆性等的研究。

主权项

1.一种利用枸杞茉莉酸代谢途径重要酶基因提高植物抗逆性的方法，该植物为拟南芥，其特征在于包括的步骤：将阳性拟南芥用200uMNaCl/0.5cm打孔器/4℃/处理后，在0h、0.5h、1h、2h、4h、8h、24h小时取叶片；叶片RNA 的分离 采 用 RNeasy Plant Mini Kit试剂盒,用分光光度计测定OD260 和OD280 值，根 据OD260/OD280值判断RNA的质量，用琼脂糖凝胶电泳检测的RNA的完整性；RNA提取按照该试剂盒说明书进行；具体步骤为：1）称取100 mg的枸杞叶片，在液氮中研磨至细粉末状，转到RNase‑free、液氮预冷的2 mL离心管中，使液氮挥发，但样品不能解冻；2）加入450 μL含有v/v 的1%β‑巯基乙醇的RLT Buffer，用力振荡，56 ℃水浴1‑3 min；3）将裂解液转移至放在2 mL收集管上的紫色QIAshredder离心柱上，12000 r/min，离心2 min，弃掉离心柱，将上清液转移至新的离心管中；4）加入200 μL的100%乙醇到裂解液中，用移液器快速混匀；5）将混匀后的溶液转移至放在2 mL收集管上的粉色RNeasy离心柱上，12000 r/min，离心15 s，弃掉滤液；6） 加入700 μL的RW1 buffer到粉色RNeasy离心柱中，12000 r/min，离心15 s，弃掉滤液；7）加入500 μL的RPE Buffer到粉色RNeasy离心柱中，12000 r/min，离心15 s，弃掉滤液；8）加入500 μL的RPE Buffer到粉色RNeasy离心柱中，12000 r/min，离心2 min，小心移走2 mL收集管；9） 将粉色RNeasy离心柱转移至新的2 mL收集管中，12000 r/min，离心1 min；10）再将粉色RNeasy离心柱转移至新的1.5 mL收集管中，加入50 μL RNase‑free的无菌水，12000 r/min，离心1 min；11） 将步骤10）中收集管内收集到的液体再次转移至粉色RNeasy离心柱中，12000 r/min，离心1 min；12）取2 μL枸杞叶片总RNA在含有2%甲醛的w/v为 0.7%的琼脂糖凝胶中检测，测定RNA浓度；用TransScriptTM one –step gDNA Rmoval and cDNA synthesis SuperMIx合成cDNA第一链；反应体系为：TotalRNA 5ul,Random Primer，0.1ug/ul， 1ul，2×TSReaction Mix 10ul,TransScriptTM 1ul，gDNA Remover 1ul，RNase‑free Water 2ul；反应条件为25℃10min，42℃ 30min，85℃ 5min；将合成的cDNA稀释10倍后作为模板；设计引物qPCRAOS15’‑AGCAACCATTTCTTCTTCCTCG‑3’,qPCRAOS25’‑GTCACGTTCATTGAGCTCGT‑3’,qPCRAOC1:5’‑GATCTTGTCCCCTTCAGCAA‑3’，qPCRAOC2：5’‑AGATCTTGTCCCCTTCAGCA‑3’，qPCROPR1:5’‑TCATCTTGACGCCATGGACT‑3’，qPCROPR2:5’‑ATGTGCCTCCTCCTCTTCAC‑3’用TransStartTM Top Green qPCR SuperMix做RT‑qPCR；反应体系为：Forward Primer，10uM， 0.5ul，Reverse Primer，10uM， 0.5ul，2×TransStartTM Top Green qPCR SuperMix 12.5ul，passive Reference Dye，0.5ul Template 1ul ；反应条件为 94℃ 30s,94℃ 5s ，60℃ 15s，72℃ 10s，40个循环；处理数据后得到结果说明盐、低温、受伤处理后茉莉酸代谢途径三个关键酶基因LmAOS/AOC/OPR表达量提高，而且转基因拟南芥比非转基因拟南芥的长势好。