[发明专利]一种观察不同生理状态PC12细胞之间相互影响的方法

摘要

本发明公开了一种观察不同生理状态PC12细胞之间相互影响的方法，包括步骤：构建GFP稳定转染PC12细胞株；建立染毒PC12细胞和未染毒PC12细胞的共培养体系；加入不同染料检测共培养体系的ROS水平、凋亡水平、线粒体跨膜电位。本发明的方法利用直接接触混合共培养技术，将醋酸铅染毒PC12细胞与未染毒PC12细胞的共培养后，通过加入不同的染料，由于染毒PC12细胞基底颜色为绿色荧光，可与不同颜色荧光叠加，这样就可区分出染毒PC12细胞，从而可以观察染毒PC12细胞对周边未染毒正常PC12细胞正常生理状态是否造成了影响，有效区分同一培养环境下的PC12细胞不同生理状态。

主权项

一种观察不同生理状态PC12细胞之间相互影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、构建GFP稳定转染PC12细胞株将处于对数生长期的PC12细胞弃去原培养液，用PBS洗涤后加入适量Trypsin‑EDTA，消化后接种至六孔板，待细胞完全贴壁后进行转导，转导前，每孔细胞换成新鲜的HD+10％FBS培养基或1640+20％FBS培养基，每株各选取一孔细胞加入30μL的Lenti‑eGFP/Neo，充分摇匀后培养箱中培养转导7小时后，吸去含有Lenti‑eGFP/Neo的培养基，换成新鲜的HD+10％FBS培养基或1640+20％FBS培养基，再放入培养箱中培养转导48小时，构建得到GFP‑PC12；(2)、共培养体系建立设置两个共培养体系：一是在GFP‑PC12中加入毒性因子培养后，将PC12与经MPb处理的GFP‑PC12按等比例混合共培养；二是将PC12与GFP‑PC12按等比例混合共培养，两个培养体系均于37℃共培养20分钟后，用PBS冲洗细胞2～3次；(3)、检测共培养体系的ROS水平、凋亡水平、线粒体跨膜电位分别在两个共培养体系中加入Hoechst33342染料进行核复染，激光共聚焦分析细胞中ROS水平；分别在两个共培养体系中加入TMRM进行线粒体跨膜电位检测；分别在两个共培养体系中加入AnnexinV‑PE或7‑AAD进行细胞凋亡水平检测。