[发明专利]一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法，突破针对单一过敏原逐个发展检测方法的免疫分析模式，而针对虾蟹类水产品过敏原，研究制备了具有广谱识别能力的族特异性表位肽抗体，开发了一种新型的水产品过敏原检测方法，实现了水产品中过敏原的高通量快速检测。

主权项

一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)海产品中原肌球蛋白同源表位的筛选在NCBI蛋白数据库收集多种海产品原肌球蛋白的氨基酸序列，将获得的原肌球蛋白的氨基酸序列利用EBI中的Clustalw软件进行多序列比对，结果用Bioedit软件分析其中保守和非保守区域位置，筛选确定不同原肌球蛋白的共同表位，称为同源表位；2)表位肽的线性合成及鉴定将步骤1)筛选得到的同源表位采用F‑moc法进行固相合成，采用高效液相色谱进行纯化后，得到纯度为99％的表位肽，并采用质谱进行鉴定；3)表位肽多克隆抗体的制备以表位肽为抗原，结合血蓝蛋白合成完全抗原后，免疫BALB/c小鼠，制备表位肽的多克隆抗体，并通过protein G Sepharose亲和柱进行纯化，得表位肽多克隆抗体；4)海产品原肌球蛋白竞争性ELISA检测方法的建立以虾原肌球蛋白为标准品，稀释后以虾原肌球蛋白100ng/孔的包被量进行96孔板包被，将梯度浓度的虾原肌球蛋白液分别与等体积的表位肽多克隆抗体液共同加入96孔板包被孔中孵育，以辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测，以3,3`,5,5`‑四甲基联苯胺作为显色剂，用H₂SO₄终止后，测定450nm的吸光值，并绘制标准曲线；5)待检样品中原肌球蛋白的检测将待检样品中的原肌球蛋白进行抽提，以虾原肌球蛋白100ng/孔的包被量进行96孔板包被，将抽提得到的待检样品中的原肌球蛋白液与等体积的表位肽多克隆抗体液共同加入96孔板包被孔中孵育，以辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测，以3,3`,5,5`‑四甲基联苯胺作为显色剂，用H₂SO₄终止后，测定450nm的吸光值，将待检样品的OD值换算成B/B0，其中B为待检样品在450nm的OD值，B0为空白对照的OD值，根据步骤4)绘制的标准曲线计算出待检样品中原肌球蛋白的含量，当测定的OD值位于标准曲线线性区域内，即为待测样品中有原肌球蛋白检出，反之视为未检出。