[发明专利]一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种原肌球蛋白的检测方法，特别涉及一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，虾蟹类水产品的消费量日益增加，2013年全国水产品总产量5907.68万吨，人均占有量43.63千克，已经成为我国人民重要的食物来源。但虾蟹类水产品是联合国粮农组织公布的八大类食物过敏原之一，我国的调研数据也表明虾蟹类水产品是引发消费者发生过敏性疾病的主要原因。此外，处于保护消费者安全及贸易保护的目的，发达国家针对食物过敏原，制定了严格的检测标准和指标，由此形成有效的贸易壁垒。近年来我国的食品出口因为过敏原问题被扣留、退回、索赔和终止合同的事件等经常发生，部分产品甚至长期受阻。因此，水产品过敏原的问题已经成为制约我国水产品行业发展的重要瓶颈因素。

为了有效的消除或缓解水产品过敏原对人们身体健康及相关行业所造成的危害，首先要发展先进的检测技术，并在此基础上建立合理、完善的检测体系。从目前国内外的发展情况看，这一检测体系包括快速筛选检测技术和确证检测方法，首先利用前者对大量样本进行现场、快速的筛检，从中发现的疑似样本则利用后者进行最终的验证。

包括虾蟹类水产品过敏原，目前食品过敏原的确证性检测主要利用液相色谱-质谱联用等大型仪器进行，已经形成了较为成熟的检测方法。由于过敏原种类繁多，不同的水产品中过敏原或多或少的有一些差异。因此尽管免疫分析等检测手段已经取得了较快的发展并显示出巨大的潜力，但较高的研究和使用成本使它们还无法作为理想的快速筛选工具而普及使用。对于包括水产品过敏原在内的食品过敏原，目前均难以实现大量样品高效的快速筛选和现场检测，这也是当前世界食品安全研究领域的关键问题和难点问题之一。而面对当前虾蟹类水产品产量大、种类繁多、特别是以虾蟹类水产品为原料的调理食品呈现快速增长的现实情况，水产品过敏原快速筛选技术的研究和开发显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法，突破针对单一过敏原逐个发展检测方法的免疫分析模式，而针对虾蟹类水产品过敏原，研究制备了具有广谱识别能力的族特异性表位肽抗体，开发了一种新型的水产品过敏原检测方法，实现了水产品中过敏原的高通量快速检测。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

1.一种利用同源表位肽抗体检测原肌球蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)海产品中原肌球蛋白同源表位的筛选

在NCBI蛋白数据库收集多种海产品原肌球蛋白的氨基酸序列，将获得的原肌球蛋白的氨基酸序列利用EBI中的Clustalw软件进行多序列比对，结果用Bioedit软件分析其中保守和非保守区域位置，筛选确定不同原肌球蛋白的共同表位，称为同源表位；

2)表位肽的线性合成及鉴定

将步骤1)筛选得到的同源表位采用F-moc法进行固相合成，采用高效液相色谱进行纯化后，得到纯度为99％的表位肽，并采用质谱进行鉴定；

3)表位肽多克隆抗体的制备

以表位肽为抗原，结合血蓝蛋白合成完全抗原后，免疫BALB/c小鼠，制备表位肽的多克隆抗体，并通过proteinGSepharose亲和柱进行纯化，得表位肽多克隆抗体；

4)海产品原肌球蛋白竞争性ELISA检测方法的建立

以虾原肌球蛋白(虾过敏原蛋白)为标准品，稀释后以虾原肌球蛋白100ng/孔的包被量进行96孔板包被，将梯度浓度的虾原肌球蛋白液分别与等体积的表位肽多克隆抗体液共同加入96孔板包被孔中孵育，以辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测，以3,3`,5,5`-四甲基联苯胺作为显色剂，用H₂SO₄终止后，测定450nm的吸光值，并绘制标准曲线(横坐标为抗原浓度，纵坐标为吸光值)；

5)待检样品中原肌球蛋白的检测