[发明专利]尿液中exosome源性miRNAs生物标记物的检测方法

摘要

本发明公开了一种尿液中exosome源性miRNAs生物标记物的检测方法，属于分离、制备或纯化DNA或RNA的方法领域。本发明从人尿液中提取exosome小体，通过电镜与Western blot对其进行形态学及蛋白鉴定，通过NanoSight LM10对其进行大小分布分析；鉴定分析后从中提取包含miRNAs的total RNA，冷冻干燥法对total RNA进行纯化分析，然后进行反转录及荧光定量PCR扩增，分离鉴定出所需的miRNAs生物标记物。本发明以尿液为实验材料，不仅收集简便、无创、数量大，而且其内含有大量的exosome，为鉴定miRNAs生物标记物提供了物质基础，具有广阔的应用前景。

主权项

一种尿液中exosome源性miRNAs生物标记物的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：a. exosome的制备收集尿液，按照体积比为尿液:蛋白酶抑制剂混合物=50:4.22的比例加入蛋白酶抑制剂混合物；1800‑2200g条件下离心去除细胞沉淀及膜碎片；取上清，15000‑17000g条件下离心去除大直径多囊泡体；取上清， 150000‑200000g条件下离心收集沉淀；用无RNAse水重悬沉淀，再次在150000‑200000g条件下离心收集沉淀，即得exosome；以上离心操作均在1‑4°C条件下进行；b.total RNA提取及纯化按照体积比为尿液量: TRIzol LS溶液=100:1的比例，向步骤a获得的沉淀中加入TRIZOL LS溶液，混匀；并按照体积比为TRIZOL LS溶液: 氯仿=5:1的比例，加入氯仿，离心；吸取上层水相并加入异丙醇，静置过夜，离心；用75%乙醇洗涤沉淀后，离心收集沉淀，干燥，用无RNAse水重悬RNA沉淀；真空冷冻干燥仪纯化上述溶解后total RNA；c.合成miRNA cDNA第一链①miRNA 3'末端加Poly(A)反应；②Poly(A)修饰的miRNA逆转录反应；d．荧光定量qPCR反应将步骤c②中获得的miRNA第一链cDNA进行hsa‑miR‑15b‑3P，hsa‑miR‑15a‑3P及hsa‑miR‑135b‑5P 的荧光定量检测。