[发明专利]生物纳米补片的制备法及用途

摘要

本发明公开了一种经黄芪甲苷诱导BMSC复合聚乳酸‑羟基乙酸纳米颗粒修饰的小肠粘膜下层基质构建生物纳米补片的制备方法，先采用复乳法制备出聚乳酸‑羟基乙酸纳米颗粒(PLGA)；采用脱细胞技术，制备具有天然三维超微结构的小肠粘膜下层基质(SIS)，使PLGA纳米颗粒粘附于SIS表面，经PLGA纳米颗粒表面修饰后的SIS，将更加有利于宿主细胞的粘附和生长；通过黄芪甲苷诱导BMSC，促进其增殖分化，并使之复合生长于PLGA纳米颗粒表面修饰的猪小肠粘膜下层基质(PLGA‑SIS)，从而得到理化性质稳定、生物相容性好、力学强度高、并且利于组织再生的AS‑BMSC‑PLGA‑SIS生物补片。

主权项

1.生物纳米补片的制备方法，其特征是：采用复乳法制备得到核心粒径为150～200nm的PLGA纳米颗粒；采用脱细胞技术，制备得到SIS，使PLGA纳米颗粒粘附于SIS表面，得PLGA‑SIS；通过黄芪甲苷诱导BMSC，促进其增殖分化，并使之复合生长于PLGA‑SIS；得生物纳米补片AS‑BMSC‑PLGA‑SIS；所述PLGA纳米颗粒为聚乳酸‑羟基乙酸纳米颗粒；所述SIS是小肠粘膜下层基质；所述制备方法是依次进行以下步骤：1)、室温下，取PLGA溶于有机溶剂Ⅰ中，得到有机溶液，所述PLGA与有机溶剂Ⅰ的质量体积比为1g：80～160ml；泊罗沙姆188搅拌下溶于去离子水中，得到水溶液，泊罗沙姆188与去离子水的质量体积比为1g：90～110ml；所述PLGA为聚乳酸‑羟基乙酸共聚物；所述有机溶剂Ⅰ为丙酮：乙醇＝2.5～3.5:1的体积比；2)、室温下，将有机溶液于搅拌下滴加到水溶液中，所述PLGA与泊罗沙姆188的质量比为1:3.5～4.5；滴加完毕后，继续搅拌30～60min，得到带乳光的纳米悬浊液；3)、将带乳光的纳米悬浊液于37～40℃用旋转蒸发仪旋蒸90～120min，得到高分子胶体悬浮液；4000～6000rpm高速离心25～35min弃去沉淀，得到PLGA纳米乳液；4)、将猪小肠制成小肠粘膜下层基质；5)、将小肠粘膜下层基质先用有机溶剂Ⅱ进行浸泡10～14h，再用去离子水冲洗；有机溶剂Ⅱ为甲醇：氯仿＝1:0.9～1.1体积比混合而得；6)、将步骤5)所得的小肠粘膜下层基质经消化后，用去生理盐水冲洗；7)、将步骤6)所得的小肠粘膜下层基质先浸泡在质量浓度为0.5％的十二烷基磺酸钠溶液中，振摇3～4h，去离子水洗净；然后再用体积浓度为0.1％的过氧乙酸溶液浸泡20～40min后，去离子水洗净；所述体积浓度为0.1％的过氧乙酸溶液的配制方法为：利用体积浓度为20％的乙醇水溶液作为稀释剂对过氧乙酸进行稀释，从而使最终所得的过氧乙酸溶液中过氧乙酸的体积浓度为0.1％；最后干燥，密封后钴‑60辐射灭菌；8)、无菌环境下，将步骤7)所得的小肠粘膜下层基质放入DMEM高糖培养液中浸泡22～26h后，吸除小肠粘膜下层基质表面多余的DMEM高糖培养液；加入由PLGA纳米乳液和DMEM高糖培养液组成的混合液浸泡12～24h后，再次吸除小肠粘膜下层基质表面的多余的混合液，得到PLGA‑SIS；所述混合液中，PLGA纳米乳液和DMEM高糖培养液的体积比为1:1.8～2.2；9)、将第三代BMSC细胞经消化离心后，用DMEM高糖培养液稀释至BMSC细胞的浓度为1.8～2.2×105cell/ml，得BMSC细胞悬液；将BMSC细胞悬液滴加在步骤8)所得的PLGA‑SIS于37℃、5％CO2培养箱中静置培养22～26h后，加入DMEM高糖培养液继续于37℃、5％CO2培养66～78h，中间更换一次DMEM高糖培养液；10)、将黄芪甲苷溶于DMEM高糖培养液中，从而配制成浓度为黄芪甲苷浓度为150～170μmol/L的含黄芪甲苷的DMEM高糖培养液；将步骤9)的所得物用上述含黄芪甲苷的DMEM高糖培养液进行培养液的更换，利用所述含黄芪甲苷的DMEM高糖培养液对BMSC细胞于37℃，5％CO2的条件下干预22～26h后，得到生物纳米补片。