[发明专利]一种C型EV71病毒的TaqMan荧光实时定量PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种C型EV71病毒的 TaqMan荧光实时定量PCR检测方法，以克隆EV71-2010FJLY008株型病毒VP1基因并体外转录成RNA为标准品，在此基础上建立TaqMan探针荧光定量PCR检测方法；该方法包括选择EV71 C基因型病毒保守区VP1基因设计引物和探针，设计实验找到最优条件下的退火温度、引物浓度和探针浓度；在引物外围设计一对克隆引物，并扩增片段，用该片段构建重组质粒，以构建好的重组质粒线性化后作为模板，转录获得RNA，系列稀释后作为标准品，进行实时PCR反应，建立了Ct/LogCopynumber工作曲线；经验证该检测体系具有较好的重复性，特异性和灵敏性，能够准确、快速、便捷的定量检测EV71 C型病毒。

主权项

一种C型EV71病毒的 TaqMan荧光实时定量PCR检测方法，其特征在于按如下步骤进行：（1）将EV71‑2010FJLY008株型病毒的RNA逆转录为cDNA，以逆转录的cDNA为模板，采用如下克隆引物扩增基因片段：上游引物：5’‑CGCAAGCTTTCATCAAATGCTAGTGAYGAG‑3’，下游引物：5’‑CACGAATTCCCCGTATTCAAGYTCTTTCTC‑3’；（2）将基因片段构建重组质粒并纯化，纯化后的克隆载体线性化后进行体外转录，并对转录完成的RNA进行RNA纯化，测其OD值 ，通过OD值计算RNA拷贝数；（3）将已知拷贝数的RNA做10倍梯度稀释，配制拷贝数为10³～10⁹copies∕μl的溶液，在荧光定量PCR反应仪中进行实时PCR反应，建立了Ct/LogCopynumber工作曲线；（4）收集培养的EV71病毒上清样本，并提取样本的RNA；（5）按照常规荧光定量PCR检测方法检测样品中EV71病毒的含量，其中定量检测的引物和探针为：上游引物：5’‑TGGAGCCCCTAAGCCAGATT‑3’，下游引物：5’‑CTCGCAGGTGACATGAATGG‑3’，探针probe：5’(FAM)‑CCTTGCATGGCAAACCGCCACTAAC‑(TAMRA)3’。