[发明专利]脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法

摘要

本发明涉及抗早疫病材料筛选方法技术领域，是一种脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法；按下述步骤进行第一步，病原菌的分离；第二步，病原菌的纯化；第三步，孢子囊悬浊液的制备；第四步，接种。本发明脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法较传统筛选方法误差小、筛选时间短和筛选成本低；同时本发明脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法弥补了新疆地区在马铃薯早疫病研究及防治方面的空白，建立了一套适合新疆地区马铃薯抗早疫病试管苗的筛选方法，大大提高了早疫病鉴定的及时性、有效性及准确性，在快速鉴定及防治疫病方面具有重要意义。

主权项

一种脱毒马铃薯试管苗抗早疫病的筛选方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，病原菌的分离，采集不同地区大田内的马铃薯早疫病病叶，将马铃薯早疫病病叶采集后经自来水冲洗1次至3次，冲洗后放入乙醇水溶液中浸泡20s至30s，浸泡后再放入升汞水溶液中浸泡10s至20s，用无菌水冲洗3遍至5遍，后用灭菌解剖刀取出病健交界的叶片，将病健交界的叶片背面朝上置于PDA平板培养基上，每皿放入3片至4片叶片，置于25℃的培养箱中黑暗培养3d至5d，培养后将叶片上的病原菌分离得到病原菌；第二步，病原菌的纯化，将分离后的病原菌置于25℃的培养箱中黑暗培养2d至3d，挑选直径为1cm至2cm的菌落镜检，确认目标菌落A，在目标菌落A的边缘挑取一小块带有菌丝的培养基再移接于PDA培养基上进行纯化，直至菌落生长整齐一致无杂菌出现为止，即得到纯化后的病原菌；第三步，孢子囊悬浊液的制备，在无菌条件下，将纯化后的病原菌接种至PDA平板培养基上常温保存，在光照下培养14 d后生成孢子囊，在无菌条件下向PDA平板培养基上注入无菌蒸馏水冲洗过滤，过滤后收集孢子囊悬浊液，镜检并稀释到6个孢子囊/100倍视野后得到孢子囊悬浊液；第四步，接种，待不同品种的马铃薯脱毒试管苗长至7叶至8叶期时，挑选不同品种的马铃薯脱毒试管苗，每个品种分为处理组与对照组两组，处理组随机挑选60株至100株马铃薯脱毒试管苗，对照组随机挑选60株至100株马铃薯脱毒试管苗，处理组在无菌环境下用移液枪吸取10ul孢子囊悬浊液接种在脱毒试管苗底部距培养基1cm至2cm的根茎处，对照组以接种10ul无菌水作为对照；接种后处理组和对照组马铃薯脱毒试管苗均置于光照为2000lx至3000lx、温度为20℃至25℃的条件下观察培养；待接种15d至20d后，当接种后的马铃薯脱毒试管苗均表现为抗病时为具有抗早疫病的脱毒马铃薯试管苗；其中：PDA培养基按下述方法得到：称取200g新鲜马铃薯，洗净去皮切片，加去离子水1000mL煮沸15min，纱布过滤后加去离子水补足至1000mL，再加12g葡萄糖和10g至12g琼脂粉，煮沸待琼脂粉完全熔化后得到PDA培养基；病健交界的叶片大小为0.5cm2至1cm2；乙醇水溶液为体积百分比为75%的乙醇水溶液；升汞水溶液为质量百分比为0.1%的升汞水溶液。