[发明专利]肝源性表达NG2的干细胞群作为种子细胞在体外3‑D培养重建人工肝脏中的应用及方法

摘要

本发明公开了肝源性表达NG2的干细胞群(NG2+HSC)作为种子细胞在体外3‑D培养重建人工肝脏中的应用及方法，具体是将NG2+HSC注入全肝去细胞天然生物支架中，然后加入能使NG2+HSC重建为人工肝脏的培养基，模拟体内肝组织器官发育生成的微环境体外三维(3‑D)培养重建肝脏器官，本发明的培养方法简单，成本低，培养时间短，21天即能形成完成的肝脏器官样轮廓，并且培养获得的人工肝脏器官具有正常肝组织类似的肝小叶结构，同时肝脏功能性蛋白也随着培养时间的延长而增加，并且对硬化肝脏和急性肝衰竭具有修复和功能恢复作用，能作为肝移植供体使用，对临床治疗终末期肝病具有重要意义。

主权项

肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2+HSC作为种子细胞在体外3‑D培养重建人工肝脏的方法，其特征在于，包括如下步骤：将NG2+HSC注入全肝去细胞生物支架中，然后加入能使NG2+HSC重建为人工肝脏的条件培养基，模拟肝组织器官发育的微环境体外3‑D培养，诱导NG2+HSC生成人工肝脏；所述微环境为在37℃、体积分数为5% CO2条件下分阶段动态培养，第一阶段1～7天，使用CM1培养基培养，第二阶段8～14天，使用CM2培养基培养，第三阶段15～21天，使用CM3培养基培养，每三天换培养基一次；培养过程中白天水平旋转培养，转速为20~40 rpm/min，晚上采用纵向旋转和水平旋转相结合的3‑D旋转培养，转速小于20 rpm/min；所述CM1培养基为含有内皮细胞生长因子、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4；所述CM2培养基为含有肝细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、牛胰岛素、人转铁蛋白、左旋甲状腺素、亚硒酸钠、腐胺、孕激素、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4；所述CM3培养基为含有肝细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、抑瘤素M、地塞米松、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4；所述DMEM完全培养液包括如下组分：100U/mL 青霉素‑G，100 µg/mL 链霉素，5 mM L‑谷氨酰胺，1×非必须氨基酸，1×丙酮酸钠和25 mM HEPES。