[发明专利]肝源性表达NG2的干细胞群作为种子细胞在体外3‑D培养重建人工肝脏中的应用及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及肝源性表达神经-胶质抗原2阳性细胞群(NG2⁺HSC)作为种子细胞通过条件培养基微环境在体外3-D培养诱导NG2⁺HSC重建肝脏器官中的应用，还涉及利用NG2⁺HSC重建肝脏器官的方法。

背景技术

终末期肝病(End-stage liver diseae,ESLD)包括肝硬化(Liver cirrhosis)和急性肝衰竭(Acute liver failure)死亡率高，严重危害人类健康。而当前唯一有效治疗手段是肝移植，但是肝移植又受到供体匮乏原因故难以广泛应用。因此，寻找有效的肝脏功能替代技术是解决这一问题的关键。目前借助体外等暂时辅助或替代肝脏等人工肝脏方法，例如生物型人工肝脏(Bioartificial liver,BAL)和物理型人工肝脏，虽然能够清除因肝衰竭产生或增加的各种有害物质，补充需肝脏合成或代谢的蛋白质等必须物质，改善患者水、电解质及酸碱平衡等内环境，但BAL只是暂时改善了晚期肝病患者症状，始终无法实现肝脏功能的全部替代。虽然近年发展的天然去细胞肝脏支架已取得进步，但由于缺乏有效的种子细胞以及诱导其生成功能性全肝器官的微环境，故使最大程度仿造原有肝脏器官以达到制成工程化的新器官的目的至今世界科学家们未能如愿以偿。

为此，急需提供一种生成功能性全肝的种子细胞，通过科学培养，能够生成工程化的新型肝脏样器官。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供生成功能性全肝的种子细胞即NG2⁺HSC，该细胞经培养后能够发育为类肝样组织，并具有肝脏结构和功能；本发明的目的之二在于提供利用NG2⁺HSC细胞群在体外重建人工肝脏的方法。

为实现上述发明目的，经研究，本发明提供如下技术方案：

1、肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏中的应用。

本发明所指的肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群是表达神经-胶质抗原2(Neuro-glia antigen2，NG2)的肝源性干细胞/祖先细胞(Hepatic stem/progenitor cells，HSC)(简称为NG2⁺HSC)，NG2⁺HSC可以来源于胚胎期未发育成熟的肝脏，也可以来源于成体肝脏，来源于成体肝脏的表达神经胶质抗原2的干细胞群制备方法见公开号为102899291A的中国专利，也可以使用现有技术中的其他方法分离，即只要肝源性的具有发育学特性和干细胞潜能的NG2阳性细胞群同样能够实现本发明目的。

2、肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，包括如下步骤：将NG2⁺HSC注入全肝去细胞生物支架(Whole decellualrized liver scaffold，WDLS)中，然后加入能使NG2⁺HSC重建为人工肝脏的条件培养基，模拟肝组织器官发育的微环境体外3-D培养，诱导NG2⁺HSC生成(重建)人工肝脏。

本发明中的WDLS可以按照本领域现有的方法制备，优选的，所述WDLS按如下方法制备：

(1)取离体全肝供体，然后从腹主动脉灌注生理盐水洗出红细胞；

(2)从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水开始去除细胞成分；

(3)从门静脉和肝动脉同时灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液继续去除细胞成分；所述SDS-Trypsin-EDTA混合液中含SDS，胰酶和EDTA；

(3)从门静脉和肝动脉灌注无菌双蒸水洗出SDS-Trypsin-EDTA混合液；

(4)从门静脉和肝动脉灌注无菌1×PBS，恢复生理状态，制得全肝去细胞生物支架。

更优选的，按如下步骤制备全肝去细胞生物支架：

(1)取离体全肝供体，然后以速度为5mL/min体内腹主动脉灌注生理盐水0.5小时；

(2)以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水2小时；