[发明专利]肝源性表达NG2的干细胞群作为种子细胞在体外3‑D培养重建人工肝脏中的应用及方法

权利要求书

1.肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，其特征在于，包括如下步骤：将NG2⁺HSC注入全肝去细胞生物支架中，然后加入能使NG2⁺HSC重建为人工肝脏的条件培养基，模拟肝组织器官发育的微环境体外3-D培养，诱导NG2⁺HSC生成人工肝脏；

所述微环境为在37℃、体积分数为5% CO₂条件下分阶段动态培养，第一阶段1～7天，使用CM1培养基培养，第二阶段8～14天，使用CM2培养基培养，第三阶段15～21天，使用CM3培养基培养，每三天换培养基一次；培养过程中白天水平旋转培养，转速为20~40 rpm/min，晚上采用纵向旋转和水平旋转相结合的3-D旋转培养，转速小于20 rpm/min；

所述CM1培养基为含有内皮细胞生长因子、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4；

所述CM2培养基为含有肝细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、牛胰岛素、人转铁蛋白、左旋甲状腺素、亚硒酸钠、腐胺、孕激素、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4；

所述CM3培养基为含有肝细胞生长因子、碱性成纤维生长因子、抑瘤素M、地塞米松、细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的混合液，所述细胞破碎并去除细胞碎片的哺乳动物发育期肝脏滤液和DMEM完全培养液的体积比为1:4；

所述DMEM完全培养液包括如下组分：100U/mL 青霉素-G，100 µg/mL 链霉素，5 mM L-谷氨酰胺，1×非必须氨基酸，1×丙酮酸钠和25 mM HEPES。

2.根据权利要求1所述肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，其特征在于，所述全肝去细胞生物支架的制备方法如下：

（1）取离体全肝供体，然后从腹主动脉灌注生理盐水洗出红细胞；

（2）从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水去除细胞成分；

（3）从门静脉和肝动脉同时灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液继续去除细胞成分；所述SDS-Trypsin-EDTA混合液中含SDS，胰酶和EDTA；

（4）从门静脉和肝动脉灌注无菌双蒸水洗出SDS-Trypsin-EDTA混合液；

（5）从门静脉和肝动脉灌注无菌1×PBS，恢复生理状态，制得全肝去细胞生物支架。

3.根据权利要求2所述肝源性表达神经胶质抗原2的干细胞群NG2⁺HSC作为种子细胞在体外3-D培养重建人工肝脏的方法，其特征在于，所述全肝去细胞生物支架的制备方法如下：

（1）取离体全肝供体，然后以速度为5mL/min体内腹主动脉灌注生理盐水0.5小时；

（2）以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水2小时；

（3）以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注SDS-Trypsin-EDTA混合液48小时，所述SDS-Trypsin-EDTA混合液含质量分数为1%的SDS，质量分数为0.005%的胰酶和质量分数为0.002%的EDTA；

（4）以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌双蒸水6小时；

（5）以5mL/min速度从门静脉和肝动脉同时灌注无菌1×PBS 1.5小时，制得全肝去细胞生物支架。