[发明专利]路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法

摘要

本发明涉及一种路氏双髻鲨血管生成抑制因子的制备方法。制备时经过路氏双髻鲨软骨匀浆，盐酸胍抽提，丙酮沉淀分级、酶解、凝胶过滤层析、细胞膜色谱纯化和高效液相色谱纯化，得Pro‑Asp‑Tyr‑Lys‑Phe‑Lys。该血管生成抑制因子能有效抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成，对荷Lewis肺癌小鼠肺癌组织的血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子三种促血管生成因子的表达有明显的抑制作用。

主权项

路氏双髻鲨血管生成抑制因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的制备：将破碎匀浆的路氏双髻鲨软骨按固液比1 g：8～10 mL加入到1.0 mol/L盐酸胍溶液中，4 ℃、振荡抽提32～36 h后，于4 ℃、10 000 r/min离心15～20 min，取上清液装入截留分子量为1 kDa的透析袋中，利用pH 7.6的Tris‑HCl缓冲液于4℃以下透析22～24 h，得路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液；路氏双髻鲨软骨蛋白粗提液置于4 ℃，缓慢加入4 ℃以下预冷的丙酮至丙酮浓度为30%，静置0.5～1 h后，于4 ℃以下10 000 r/min离心15～25 min，取上清液加入4 ℃以下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%，静置0.5～1 h后，4 ℃以下、10 000 r/min离心15～25 min，取沉淀置于截留分子量为1 kDa 的透析袋内用双蒸水于4 ℃以下透析22～24 h，透析液冷冻干燥，得路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分；2）路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分的酶解：将路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分按固液比1 g : 20～25 mL加入浓度0.05 mol/L、pH 9～10的Gly‑NaOH缓冲液，得混合液；将混合液温度升至45～55 ℃预热5～10 min，按照路氏双髻鲨软骨活性蛋白组分质量的1.5～2.5%加入酶活力≥2.0×10⁵ U/g的碱性蛋白酶，酶解温度为45～55 ℃，酶解5～6 h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15 min后，10 000g离心20～25 min，取上清液，即为软骨活性蛋白组分酶解产物；3）路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备：将制备的软骨活性蛋白组分酶解产物采用1 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依次经凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱纯化，得到路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子。