[发明专利]ssDNA次级文库的制备方法

摘要

本发明提供了一种制备ssDNA次级文库的方法,包括如下步骤步骤一使用均有生物素标记的上、下游引物对ssDNA文库进行PCR扩增，获得携有生物素的dsDNA；步骤二以步骤一得到的携有生物素的dsDNA扩增产物为模板，使用无生物素标记的上游引物，以及生物素标记的下游引物，进行不对称PCR扩增得到混合扩增产物；步骤三在步骤二的混合扩增产物中加入链霉亲和素磁珠，去除扩增产物中所有携带生物素的dsDNA和副产品，从而获得ssDNA次级文库。本发明提供了一种高纯度、高产量的ssDNA次级文库的制备方法，此制备方法同时保证了ssDNA的亲和性与特异性。

主权项

一种ssDNA次级文库的制备方法,包括如下步骤：步骤一：使用均有生物素标记的上、下游引物对ssDNA文库进行PCR扩增，获得携有生物素的dsDNA；步骤二：以步骤一得到的携有生物素的dsDNA扩增产物为模板，使用无生物素标记的上游引物，以及生物素标记的下游引物，进行不对称PCR扩增得到混合扩增产物；步骤三：在步骤二的混合扩增产物中加入链霉亲和素磁珠，去除扩增产物中所有携带生物素的dsDNA和副产品，从而获得ssDNA次级文库；所述步骤一中，PCR反应体系如下所示：10×Buffer                       5μlMgCl2 25mM                       3μldNTP 10mM                        2μlTaq酶 5U/μl                      0.5μl生物素标记上游引物 10pmol/μl     5μl生物素标记下游引物 10pmol/μl     5μlssDNA文库 50ng/μl                1μlddH2O                            28.5μl总体积                           50μl所述Taq酶选自Promega公司的型号为M1665S的试剂盒；所述步骤一中，PCR扩增条件如下所示：第一阶段：94℃      5min第二阶段：11个循环94℃      30s59℃      30s72℃      30s第三阶段：72℃      5min4℃保存；所述步骤二中，PCR反应体系如下所示：上游引物 10pmol/μl                         2μl生物素标记下游引物 0.5pmol/μl              2μldsDNA扩增产物                              1μlAmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix 2×      10μlddH2O                                      5μl总体积                                     20μl所述AmpliTaq Gold Fast PCR Master Mix 2× 来自Life Technologies公司的4390939试剂盒；所述步骤二中，PCR扩增条件如下所示：第一阶段：95℃     10min第二阶段：30个循环96℃      3s59℃      3s68℃      3s第三阶段：72℃      10s4℃保存。