[发明专利]一种Arm-PCR扩增子长度可调的引物设计方法

摘要

本发明公开了一种Arm‑PCR扩增子长度可调的引物设计方法，其通过以下步骤实现：通过icubate 2.0在线软件设计Arm‑PCR引物；在Arm‑PCR内向上下游引物的接头序列后加T连接子；Arm‑PCR反应体系的配制；Arm‑PCR反应条件的设定与运行；Arm‑PCR产物的毛细管电泳检测。由于icubate 2.0软件设计出来的Arm‑PCR引物扩增出来的产物长度相近，而毛细管电泳在检测时会有2‑3bp碱基的滑移现象，这种情况会导致结果判定不准确，所以在这种基础上本发明通过在Arm‑PCR的内向上下游引物的接头序列后加T连接子，从而改变Arm‑PCR产物的长度，使实验结果更加准确可靠。

主权项

1.一种Arm‑PCR扩增子长度可调的引物设计方法，其特征在于：所述Arm‑PCR扩增子长度可调的引物设计方法通过以下步骤实现：a、通过icubate 2.0在线软件设计Arm‑PCR引物；b、在Arm‑PCR内向上下游引物的接头序列后加T连接子；c、Arm‑PCR反应体系的配制；d、Arm‑PCR反应条件的设定与运行；e、以转基因大豆GTS40‑3‑2NOS终止子的质粒为模板进行Arm‑PCR产物的毛细管电泳检测；步骤b中在Arm‑PCR第一步扩增反应所需要的内向上下游引物的接头序列后各加1个T、2个T、3个T、4个T或5个T连接子，从而使PCR扩增子的长度改变2bp、4bp、6bp、8bp或10bp；引物组包括正向外引物Fo、反向外引物Ro、正向内引物Fi、反向内引物Ri，用于Arm‑PCR的第一步扩增；5’端ROX标记的超级上游引物Fs和下游引物Rs用于Arm‑PCR的第二步扩增，以下6组引物都是在第一组内向上下游引物Fi和Ri的接头序列后加T连接子，用于第一步扩增的引物组的核苷酸序列分别如下所示：1)Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACAGATTGAATCCTGTTGCC；Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG；2)Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTAGATTGAATCCTGTTGCC；Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG；3)Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTTAGATTGAATCCTGTTGCC；Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG；4)Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTTTAGATTGAATCCTGTTGCC；Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG；5)Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTTTTAGATTGAATCCTGTTGCC；Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG；或6)Fo:CAAACATTTGGCAATAAAGTTT；Fi:GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTACTTTTTAGATTGAATCCTGTTGCC；Ri:CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGTTTTTTTATTTTGTTTTCTATCGCGTATT；Ro:CTAGTAACATAGATGACACCG；用于第二步扩增的超级上、下游引物的核苷酸序列为：超级上游引物Fs：GCAGTCGTGCAGCAAGTTTTAC；超级下游引物Fs：CGAGTCCTGCGGTCTCAAATGT。