[发明专利]胸腺素α1的固相片段合成方法

摘要

本发明公开一种胸腺素α₁的合成工艺，根据胸腺素α₁的困难合成序列设计困合成多个片段；在困难序列的区域采用固相片段缩合方法，提高合成质量和缩短合成时间；而在易合成序列区域采用常规的逐步缩合法；在Wang Resin上得到全保护的胸腺素α₁肽树脂；使用TFA/间甲酚或TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚作为裂解试剂，裂解肽树脂得到粗肽；将粗肽溶解、过滤，通过制备型反相HPLC纯化、脱盐、旋蒸及冻干得到纯度可达到99%以上的胸腺素α₁成品。本发明方法合成的粗肽纯度可达到80%左右，易纯化，总收率可达到30%。本发明方法生产胸腺素α₁的总收率和产品质量比文献报道的其它方法均有了较大幅度的提高，且生产周期能缩短40‑50%，降低了生产成本，适合于规模化制备高纯度的胸腺素α₁。

主权项

1.一种胸腺素α1的固相片段合成方法，其特征在于：包括以下步骤：胸腺素α1为：Ac‑Ser‑Asp‑Ala‑Ala‑Val‑Asp‑Thr‑Ser‑Ser‑Glu‑Ile‑Thr‑Thr‑Lys‑Asp‑Leu‑Lys‑Glu‑Lys‑Lys‑Glu‑Val‑Val‑Glu‑Glu‑Ala‑Glu‑Asn‑OH，所述胸腺素α1从C端到N端分为C末端片段A、片段B和N末端片段E；所述C末端片段A为6个氨基酸，所述片段B为8个氨基酸，所述N末端片段E为4个氨基酸，所述C末端片段A和片段B在肽序上为连续片段；所述C末端片段A通过以下工艺获得：步骤一、将Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、HOBt在溶剂中溶解后，再加入DIC活化形成氨基酸活化液；步骤二、将所述氨基酸活化液、Wang Resin树脂混合并加入二甲氨基吡啶进行缩合反应获得Fmoc‑Asn28(Trt)‑Wang Resin，再去除Fmoc保护基；步骤三、再根据肽序循环步骤一和步骤二，依次将Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH和Fmoc‑Val‑OH缩合到树脂上，脱除Fmoc得到全保护C末端片段A的肽树脂；所述片段B通过以下工艺获得：步骤一、将Fmoc‑Val‑OH在溶剂中溶解后，加入所需DIPEA总量的2/3，活化形成氨基酸活化液；步骤二、将所述氨基酸活化液、2‑CTC Resin树脂混合并加入剩余1/3DIPEA进行缩合反应获得氨基酸‑CTC Resin树脂，再去除Fmoc保护基获得脱保护氨基酸‑CTCResin树脂；步骤三、将Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH与HOBt在溶剂中溶解后，再加入DIC/HOBt活化形成氨基酸活化液；步骤四、将步骤三所述氨基酸活化液、步骤二的脱保护氨基酸‑CTC Resin树脂混合进行缩合反应获得中间氨基酸‑CTC Resin树脂；步骤五、再根据肽序循环步骤三和步骤四，按照肽序依次将若干个氨基酸直到Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH逐步缩合到步骤四的树脂上，再通过体积比为1/4的TFE/DCM溶液将多肽与树脂分离从而获得全保护片段B；将所述全保护片段B加入DCM/DMSO的混合溶剂，再依次加入DIC/HOBt活化后，再加入所述全保护C末端片段A的肽树脂，缩合反应合成全保护片段C；按照肽序，在全保护片段C的肽树脂依次将Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH和Fmoc‑Ser(tBu)‑OH偶联到全保护片段C上，脱除Fmoc保护基团后得到全保护片段D肽树脂；所述N末端片段E为逐步缩合法依次完成Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH和Fmoc‑Ser(tBu)‑OH与2‑CTC Resin树脂缩合，再将多肽与树脂分离从而获得片段E；将片段E全溶解于DMF/DCM＝2/1的混合溶剂中，加入HOBt搅拌至全溶，再投入所述全保护片段D肽树脂，得到胸腺素α1肽树脂；将胸腺素α1肽树脂加入裂解混合试剂，裂解2h，滤除树脂，得到滤液，将滤液缓缓加入至冰冷的无水乙醚中，静置，去除上清液，离心、洗涤、真空干燥得到粗肽胸腺素α1。