[发明专利]胸腺素α1的固相片段合成方法

说明书

本发明公开一种胸腺素α₁的合成工艺，根据胸腺素α₁的困难合成序列设计困合成多个片段；在困难序列的区域采用固相片段缩合方法，提高合成质量和缩短合成时间；而在易合成序列区域采用常规的逐步缩合法；在Wang Resin上得到全保护的胸腺素α₁肽树脂；使用TFA/间甲酚或TFA/苯甲硫醚/EDT/苯甲醚作为裂解试剂，裂解肽树脂得到粗肽；将粗肽溶解、过滤，通过制备型反相HPLC纯化、脱盐、旋蒸及冻干得到纯度可达到99%以上的胸腺素α₁成品。本发明方法合成的粗肽纯度可达到80%左右，易纯化，总收率可达到30%。本发明方法生产胸腺素α₁的总收率和产品质量比文献报道的其它方法均有了较大幅度的提高，且生产周期能缩短40‑50%，降低了生产成本，适合于规模化制备高纯度的胸腺素α₁。

技术领域

本发明涉及多肽药物化学合成领域，具体涉及一种胸腺素α1的固相片段合成方法。

背景技术

胸腺素a₁是由胸腺分泌的一种重要的多肽类免疫调节因子，具有显著增强免疫功能的作用，被公认为特异性调节免疫失衡状态及增强免疫力最有效的药物。胸腺素a₁最初是从小牛胸腺中提取出来的。胸腺素a₁由28个氨基酸残基组成，分子量为3108，等电点为4.2, N端含有乙酰化结构。胸腺素a₁通过刺激外周血液淋巴细胞丝裂原来促进T淋巴细胞的成熟，增加抗原或丝裂原激活后T细胞分泌的干扰素α、干扰素γ以及白介素2、白介素3等淋巴因子水平，同时增加T细胞表面淋巴因子受体水平。化学合成的胸腺素a₁ (商品名为日达仙)已用于慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、恶性黑色素瘤、非小细胞性肺癌等疾病的治疗。

Ta₁的一级结构图（Lys¹⁷至Glu²⁴之间序列可以形成a~螺旋结构）

目前报道的胸腺素α₁极其类似物的制备除了从动物胸腺中提取外，还可以采用基因工程的方法和化学合成的方法。从动物胸腺中提取的方法原料来源有限，胸腺素α₁含量低，提取产品质量不高；基因工程法很难实现胸腺素α₁结构中的乙酰化修饰，重组小肽的纯化工艺复杂；化学合成法是目前生产高品质胸腺素α₁原料药的主要方法。

在标准的固相多肽合成法中，主要采用Boc/Bzl和Fmoc/tBu两种正交保护策略。用经典的Boc/Bzl策略合成胸腺素α₁，以三氟乙酸（TFA）脱除Boc保护时可以避免困难序列的形成，合成粗肽的质量较好，但此工艺中要用到剧毒的氟化氢和昂贵的聚四氟乙烯装置，因此在胸腺素α₁的规模化生产中，Boc/Bzl合成工艺逐渐被更加安全、经济、环保的Fmoc/tBu合成工艺替代。在标准的Fmoc/tBu合成工艺中，如克服因胸腺素α₁困难序列的形成导致的某些氨基酸缩合困难及六氢吡啶脱除Fmoc困难是提高合成质量的关键。

在胸腺素α₁的Fmoc/tBu固相合成工艺专利ZL200710024406.3中采用Fmoc-Asp-X(X=OtBu或 OAll)的侧链羧基与Rink Amide Resin或Rink Amide MBHA Resin的氨基相连，代替Fmoc-Asn(Trt)-OH与Wang Resin相连的常规方法，再按照逐步缩合的方法完成整个肽序的合成。此方法用Rink Resin替代Wang Resin，用Fmoc-Asp-X(X=OtBu或 OAll)代替Fmoc-Asn(Trt)-OH，更容易将第一个氨基酸连接到固相载体上，此方法具有一定的巧妙性，但本质上不会改善肽链中困难序列的合成效果，也就不会较大幅度的提高粗肽的纯度和收率等指标，Fmoc-Asp-X(X=OtBu或 OAll)和Rink Resin的价格也明显高于Fmoc-Asn(Trt)-OH和Wang Resin。