[发明专利]一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法

摘要

本发明涉及一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，通过将难溶或不溶蛋白或多肽抗原进行离心收集、洗涤、均质、制粒等工艺处理，制得在常见生理溶液中较为稳定的抗原悬液。该方法大大简化了利用难溶或不溶蛋白或多肽进行疫苗制备的生产工艺，建立了一套利用难溶或不溶蛋白或多肽抗原直接进行疫苗制备的新方法，同时给出了应用该方法进行疫苗制备的佐剂可选范围；该工艺的应用可大幅减少利用难溶或不溶蛋白或多肽进行亚单位或多肽疫苗制备的生产环节、缩短生产时间，显著减低了疫苗生产成本。

主权项

一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其特征在于依次包括如下步骤：a．取溶解于生理盐水或PBS缓冲液的抗原液，在相对离心力为7000‑10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；b．将经过a步骤得到的沉淀物用100～150倍体积（W︰V）的生理盐水或PBS重悬，接着搅拌使沉淀物均匀分散；然后在相对离心力为7000‑10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；将收集到的沉淀物用生理盐水或PBS重复洗涤3次；c．将经过b步骤得到的沉淀物在相对离心力为7000‑10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；d．接着将c步骤得到的沉淀物重悬于100～150倍体积（W︰V）的生理盐水或PBS中；接着，进行冰浴超声处理使沉淀物均匀分散，得到沉淀物悬液；e．将d步骤获得的沉淀物悬液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中，在2～8℃、600～800bar的压力下进行均质，收集第一穿出液；接着，将第一穿出液在2～8℃、1000～1200bar的压力下进行制粒，重复两次制粒过程，收集第二穿出液；f．将e步骤收集到的第二穿出液用生理盐水或PBS调整浓度到≥300µg/mL；g．向经过f步骤处理得到的第二穿出液中加入佐剂，制得疫苗；所述a步骤中的抗原液通过如下方法获得：将培养基中的工程菌进行酶解或机械裂解，离心，分别收集上清液和沉淀；将收集到的沉淀物重悬于100～150倍体积（W︰V）的TNE‑U缓冲液中，在超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声10‑20min，使沉淀物均匀分散；接着加入体积为培养基体积1/100的TNE‑U缓冲液，然后在温度为4℃的层析柜中振荡30min；接着离心收集沉淀，所述离心处理的相对离心力为7000xg、时间为15min；接着将收集到的沉淀重悬于体积为培养基体积1/100的TNE‑T缓冲液中，超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声10‑20min，使沉淀物均匀分散；接着加入体积为培养基体积1/100的TNE‑T缓冲液，然后在温度为4℃的层析柜中振荡30min，得到抗原液；所述TNE‑U缓冲液由如下方法制成：将Tris‑Base、NaCl、Urea和蒸馏水混合，然后经过0.45µm滤器过滤除菌处理，即得；其中Tris‑Base 的摩尔浓度为0.5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0.25mol/L、Urea的摩尔浓度为2‑4mol/L，所述TNE‑U缓冲液的pH值为7.4；所述TNE‑T缓冲液由如下方法制成：取脱氧胆酸和Triton X100的一种，然后与Tris‑Base、NaCl和蒸馏水混合，然后经过0.45µm滤器过滤除菌处理，即得；其中Tris‑Base 的摩尔浓度为0.5mol/L、NaCl的摩尔浓度为0.25mol/L、Triton X100的体积百分数为0.1‑1%、脱氧胆酸的质量百分数为5‑10%，所述TNE‑T缓冲液的pH值为7.4。