[发明专利]一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗制备领域，具体涉及一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法。

背景技术

作为一种对动物群体疫病的有效控制手段，动物疫苗技术优化和新型动物疫苗技术开发得到世界各国相关研究机构的重视。据统计，到2013年底，我国通过兽药GMP认证的动物疫苗生产企业有88家，是2000年前疫苗生产企业数量的4倍。动物疫苗市场的巨大需求是动物疫苗行业发展源动力。长期以来，我国用于动物传染病预防的疫苗大多是传统疫苗，随着现代生物技术的发展、不同病原致病机理的深入研究及世界各国对动物性食品安全性的要求不断提高，传统疫苗制备技术已经不能满足疫苗企业和养殖业发展需求。

对于某些原核细胞或真核细胞过量表达的重组蛋白，或者人工合成的用于疫苗制备的多肽片段，经过纯化或多次沉淀和干燥，蛋白或多肽抗原常常难溶于性质温和的缓冲液中，蛋白、多肽抗原在未达到疫苗配制所需浓度时便大量析出，这一情况使疫苗制备工艺一方面使复杂化，限制了疫苗剂型，也增加了疫苗生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种利用难溶或不溶蛋白、多肽抗原制备纳米微粒疫苗的方法，其依次包括如下步骤：

a.取溶解于生理盐水或PBS缓冲液的抗原液，在相对离心力为7000-10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；

b.将经过a步骤得到的沉淀物用100～150倍体积(W︰V)的生理盐水或PBS重悬(100-150倍体积(W:V)是指沉淀物的质量(g)与生理盐水或PBS的体积(ml)比为100-150)，接着搅拌使沉淀物均匀分散；然后在相对离心力为7000-10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；将收集到的沉淀物用生理盐水或PBS重复洗涤3次；

c.将经过b步骤得到的沉淀物在相对离心力为7000-10000xg的条件下离心处理15min，收集沉淀物；

d.接着将c步骤得到的沉淀物重悬于100～150倍体积(W︰V)的生理盐水或PBS中；接着，进行冰浴超声处理使沉淀物均匀分散，得到沉淀物悬液；

e.将d步骤获得的沉淀物悬液加入无菌的低温超高压均质机/低温纳米级微生物破碎机的上样容器中，在2～8℃、600～800bar的压力下进行均质，收集第一穿出液；接着，将第一穿出液在2～8℃、1000～1200bar的压力下进行制粒，重复两次，得到，收集第二穿出液；

f.将e步骤收集到的第二穿出液(即疫苗抗原)用生理盐水或PBS调整浓度到≥300μg/mL；

g.向经过f步骤处理得到的第二穿出液(即疫苗抗原)中加入佐剂，制得疫苗。f步骤处理得到的第二穿出液(即疫苗抗原)与佐剂进行乳化，制得疫苗。在实践中，可以根据疫苗制备剂型和佐剂使用说明对乳化方法进行调整。

本发明中，优选的方案为在g步骤中：在加入佐剂进行疫苗配制之前，根据《中国兽药典》附录方法对收集到的第二穿出液(即疫苗抗原)进行无菌检验、内毒素含量检验和纯度检验，然后将检验合格的第二穿岀液中加入佐剂进行疫苗配制。

本发明中，优选的方案为还包括步骤h：将g步骤制得的疫苗按照《中国兽药典》附录方法进行质量检验。

本发明中，优选的方案为所述e步骤中的制粒工艺制得的微粒的平均粒径为20-200nm。

本发明中，优选的方案为所述a步骤中的抗原液通过如下方法获得：将培养基中的工程菌进行酶解或机械裂解，离心，分别收集上清液和沉淀；将收集到的沉淀物重悬于100～150倍体积(W︰V)的的TNE-U缓冲液中，在超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声10-20min，使沉淀物均匀分散；接着加入体积为培养基体积1/100的TNE-U缓冲液，然后在温度为4℃的层析柜中振荡30min；接着离心收集沉淀，所述离心处理的相对离心力为7000xg、时间为15min；接着将收集到的沉淀重悬于体积为培养基体积1/100的TNE-T缓冲液中，超声破碎仪中在200w的功率下冰浴超声10-20min，使沉淀物均匀分散；接着加入体积为培养基体积1/100的TNE-T缓冲液，然后在温度为4℃的层析柜中振荡30min，得到抗原液；