[发明专利]一种小脑浦肯野细胞的体外培养方法

摘要

本发明属于细胞生物学技术领域，提供了一种浦肯野细胞的体外培养方法。本发明发法浦肯野细胞所培养的新鲜培养基是由DMEM/F-12培养基添加B27神经细胞生长添加剂组成。在体外培养第14天的浦肯野细胞能够清楚的看到浦肯野细胞的明显结构，当第28天的时候可以看到更多的树突结构，细胞发育的非常好。本发明方法培养基能在国内很容易购买。且木瓜蛋白酶的激活方法能更好的为培养浦肯野细胞服务。

主权项

一种小脑浦肯野细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤如下：（1）多聚赖氨酸处理的盖玻片准备    用100μg/μl 多聚赖氨酸包被盖玻片，盖玻片置于35mm的培养皿中 37℃ 5% CO₂培养过夜，用高压灭菌过的PBS进行清洗，在包被的盖玻片附近加入PBS，晃动培养皿，洗掉废弃的PBS，重复一次，然后置于通风厨内晾干；木瓜蛋白酶消化小脑组织后将细胞接种在盖玻片上；（2）激活木瓜蛋白酶    将 2ml PBS溶液或者不含Ca²⁺、Mg²⁺ 的D‑Hanks溶液、32.2μl 半胱氨酸、16.4μl木瓜蛋白酶 37℃ 热激30min；   （3）接种细胞①.取3只P0时期的C57BL/6鼠婴，取小脑置于D‑Hanks液中，去掉血管、脑膜，取其小脑置于D‑Hanks液中；.切碎，1000rpm离心2min后去掉上清；.加入热激后的木瓜蛋白酶、2μl DNaseⅠ，37℃消化15min；④.用1ml枪头吹打10下继续37℃消化15min；⑤.将消化好的组织经过40μm的过滤网后，加入含有FBS培养基终止消化，1000rpm离心 5min后,弃上清；⑥.加入含有血清的培养基600μl,该培养基由90vol%DMEM/F‑12和10vol%FBS组成,计数，细胞数在5*10⁵ ，37℃培养1小时；⑦.加入成新鲜培养基1ml，新鲜培养基由 DMEM/F‑12培养基中添加2vol%的B27神经细胞生长添加剂组成，此后每隔3天置换一半的新鲜培养基；    （4）细胞发育情况的检测    分别取出已经培养14、28天的浦肯野细胞进行发育情况的检测，检测的指标选取的是浦肯野细胞特异性的标记Calbindin抗体，通过免疫组化的方法来标记浦肯野细胞，在显微镜下清晰的看到浦肯野细胞的树突结构。