[发明专利]一种小脑浦肯野细胞的体外培养方法

说明书

技术领域

   本发明属于细胞生物学技术领域，特别是提供了一种浦肯野细胞的体外培养方法，适用于基础医学方面的研究。

背景技术

目前针对小脑浦肯野细胞的体外培养方法有很多，主要有如下不足：1.木瓜蛋白酶针对小脑组织的消化能力不强，不能充分消化组织块；2.在国际上培养浦肯野细胞的培养基主要是来源于日本“Sμmitomo”神经细胞培养基。

发明内容

     本发明所要解决的技术问题在于提供一种浦肯野细胞的体外培养方法。该方法使用能够很容易购买的浦肯野细胞的体外培养的培养基。

本发明针对国内的情况，进行了如下的改良：1.针对木瓜蛋白酶消化组织块效果差的情况，我们采用激活木瓜蛋白酶，采用如下方法：2ml PBS溶液( 或者不含Ca²⁺_、Mg²⁺ 的D-Hanks)、32.2μl 半胱氨酸、16.4μl 木瓜蛋白酶37℃ 热激30min。在消化组织块的时候在加入2μl DNaseⅠ。②.本实验方法培养浦肯野细胞的培养基为DMEM/F-12培养基、B27神经细胞生长添加剂，采用的是一种无血清的培养基。

    一种浦肯野细胞的体外培养方法,包括如下步骤：

（1）多聚赖氨酸处理的盖玻片准备

     用100μg/μl 多聚赖氨酸包被盖玻片，盖玻片置于35mm的培养皿中 37℃ 5% CO₂培养过夜，用高压灭菌过的PBS进行清洗，在包被的盖玻片附近加入PBS，晃动培养皿，洗掉废弃的PBS，重复一次，然后置于通风厨内晾干；木瓜蛋白酶消化小脑组织后将细胞接种在盖玻片上；

（2）激活木瓜蛋白酶

    将 2ml PBS溶液或者不含Ca²⁺、Mg²⁺ 的D-Hanks溶液、32.2μl 半胱氨酸、16.4μl木瓜蛋白酶 37℃ 热激30min；

（3）接种细胞

     ①.取3只P0时期的C57BL/6鼠婴，取小脑置于D-Hanks液中，去掉血管、脑膜，取其小脑置于D-Hanks液中；                                                .切碎，1000rpm离心2min后去掉上清；.加入热激后的木瓜蛋白酶、2μl DNaseⅠ，37℃消化15min；④.用1ml枪头吹打10下继续37℃消化15min；⑤.将消化好的组织经过40μm的过滤网后，加入含有FBS培养基终止消化，1000rpm离心 5min后,弃上清；⑥.加入含有血清的培养基600μl,该培养基由90vol%DMEM/F-12和10vol%FBS组成,计数，细胞数在5*10⁵ ，37℃培养1小时；⑦.加入成新鲜培养基1ml，新鲜培养基由 DMEM/F-12培养基中添加2vol%的B27神经细胞生长添加剂组成，此后每隔3天置换一半的新鲜培养基。

（4）细胞发育情况的检测

   分别取出已经培养14、28天的浦肯野细胞进行发育情况的检测，检测的指标选取的是浦肯野细胞特异性的标记Calbindin抗体，通过免疫组化的方法来标记浦肯野细胞，在显微镜下清晰的看到浦肯野细胞的树突结构。

    将培养好的浦肯野细胞取出，洗掉培养基，置换1xPBS清洗3次，每次5min；加入1xPBT对细胞进行破膜处理25min；0.3%H₂O₂漂洗15min；用1xPBS清洗三次，每次5min，吸干PBS溶液；用5%正常山羊血清进行封闭，室温封闭1小时；加入一抗（Calbindin，1：500，用5%正常山羊血清进行稀释），室温2小时；用1xPBS溶液清洗3次，每次10min；加入生物素标记的二抗（1：200），室温1小时；用1xPBS溶液清洗3次，每次10min；用DAB显色，待显色充分用1xPBS溶液终止显色反应。

    本发明所述的Calbindin抗体为浦肯野细胞特异性的标记分子，通过免疫荧光或者免疫组化的方法能够很好的显示出浦肯野细胞的完整的形态结构。

本发明的优点在于，所述的浦肯野细胞所培养的新鲜培养基是由DMEM/F-12培养基添加B27神经细胞生长添加剂组成，这种培养基能在国内很容易购买并且用来配制进行实验。且木瓜蛋白酶的激活方法能更好的为培养浦肯野细胞服务。

附图说明