[发明专利]一种小脑浦肯野细胞的体外培养方法在审
申请号: | 201410845553.7 | 申请日: | 2014-12-31 |
公开(公告)号: | CN104480071A | 公开(公告)日: | 2015-04-01 |
发明(设计)人: | 卢祖能;尹皓;张泉 | 申请(专利权)人: | 武汉大学 |
主分类号: | C12N5/079 | 分类号: | C12N5/079 |
代理公司: | 武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222 | 代理人: | 汪俊锋 |
地址: | 430072 湖*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 小脑 浦肯野 细胞 体外 培养 方法 | ||
1.一种小脑浦肯野细胞的体外培养方法,其特征在于,步骤如下:
(1)多聚赖氨酸处理的盖玻片准备
用100μg/μl 多聚赖氨酸包被盖玻片,盖玻片置于35mm的培养皿中 37℃ 5% CO2培养过夜,用高压灭菌过的PBS进行清洗,在包被的盖玻片附近加入PBS,晃动培养皿,洗掉废弃的PBS,重复一次,然后置于通风厨内晾干;木瓜蛋白酶消化小脑组织后将细胞接种在盖玻片上;
(2)激活木瓜蛋白酶
将 2ml PBS溶液或者不含Ca2+、Mg2+ 的D-Hanks溶液、32.2μl 半胱氨酸、16.4μl木瓜蛋白酶 37℃ 热激30min;
(3)接种细胞
①.取3只P0时期的C57BL/6鼠婴,取小脑置于D-Hanks液中,去掉血管、脑膜,取其小脑置于D-Hanks液中; .切碎,1000rpm离心2min后去掉上清;.加入热激后的木瓜蛋白酶、2μl DNaseⅠ,37℃消化15min;④.用1ml枪头吹打10下继续37℃消化15min;⑤.将消化好的组织经过40μm的过滤网后,加入含有FBS培养基终止消化,1000rpm离心 5min后,弃上清;⑥.加入含有血清的培养基600μl,该培养基由90vol%DMEM/F-12和10vol%FBS组成,计数,细胞数在5*105 ,37℃培养1小时;⑦.加入成新鲜培养基1ml,新鲜培养基由 DMEM/F-12培养基中添加2vol%的B27神经细胞生长添加剂组成,此后每隔3天置换一半的新鲜培养基;
(4)细胞发育情况的检测
分别取出已经培养14、28天的浦肯野细胞进行发育情况的检测,检测的指标选取的是浦肯野细胞特异性的标记Calbindin抗体,通过免疫组化的方法来标记浦肯野细胞,在显微镜下清晰的看到浦肯野细胞的树突结构。
2. 根据权利要求1所述的体外培养方法,其特征在于,所述的磷酸盐缓冲液PBS由8 克/升的氯化钠、0.2 克/升的氯化钾、2 克/升的磷酸氢二钠、0.2克/升的磷酸二氢钾组成。
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