[发明专利]生物反应芯片及其在PCR反应中的应用

摘要

本发明涉及一种生物反应芯片及其在PCR反应中的应用。所涉及的生物反应芯片包括主体板，所述主体板上开设有多级反应槽，每级反应槽中可容纳生物反应试剂的量不同。将多级反应槽按可容纳生物反应试剂的量从大到小排序，相邻级的反应槽可容纳生物反应试剂的体积量比为定值。本发明提供的生物反应芯片在进行PCR反应定量检测时无需定量标准品，可以进行溶液核酸浓度的定量检测，实现对核酸分子进行绝对定量检测。

主权项

一种乙肝病毒PCR绝对定量检测方法，其特征在于，方法采用生物反应芯片对乙肝HBV‑DNA样品进行PCR绝对定量检测，所述生物反应芯片包括主体板，所述主体板的直径为46mm、厚度为300μm，所述主体板上刻蚀有6级反应槽，且各级反应槽在主体板上呈圆周分布，同一级反应槽中的多个单体反应槽呈等间距圆周式分布，且沿主体板的径向从主体板边缘至中心，各级反应槽的单体反应槽直径逐渐减小，各级单体反应槽的直径：7.28mm、2.37mm、0.72mm、0.22mm、0.07mm、0.02mm；每个单体反应槽的深度均为40μm；各级单体反应槽的个数：10个、20个、20个、20个、20个、20个；各级单体反应槽体积：1.655μL、1.76E‑01μL、1.63E‑02μL、1.52E‑03μL、1.54E‑04μL、1.26E‑05μL；检测体系包括：20mM Tris‑HCl,10mM KCl,10mM(NH4)2SO4,9mM MgSO4,1.4mM dNTP,0.8M Betain,8UI Bst DNA Polymerase；引物为：外引物一对F3/B3和内引物一对FIP(F1c+F2)/BIP(B1c+B2)，引物终浓度为F3/B3 0.2μM,FIP/BIP 1.6μM；F3:5’‑CACGGGACCATGCAAGAC‑3’；B3:5’‑AAACAGTGGGGGAAAGCC‑3’；FIP:5’‑TGCAGTTTCCGTCCGAAGGTTT‑CTGCACGATTCCTGCTCAA‑3’；BIP:5’‑CGCAAGATTCCTATGGGAGGGG‑ACCACTGAACAAATGGCACT‑3’；其中F2、F1c、B2、B1c的序列为：F2:CTGCACGATTCCTGCTCAA；F1c:TGCAGTTTCCGTCCGAAGGTTT；B2:ACCACTGAACAAATGGCACT；B1c:CGCAAGATTCCTATGGGAGGGG；检测方法为：第一步，将所述PCR反应芯片固定于真空离心镀膜机上，将待测样本与PCR反应液混合，用移液器吸取足够量混合液体置于芯片中心位置；开启离心机直到多余的混合液体被移除到芯片外，取出PCR反应芯片加反应盖，并在芯片底部贴上封闭薄膜；第二步，将制作好的含有样品和PCR反应液的PCR反应芯片放在程控加热金属板或恒温加热金属板上，66℃扩增循环后，降低金属板加热温度至50℃以下去掉封闭膜，继续加热直至反应孔液体完全挥发；第三步，去掉PCR反应芯片上的玻璃盖，将反应芯片重新固定于真空离心镀膜机上，用移液器吸取足够量溴乙锭或0.1％SYBR‑GREEN置于芯片中心位置，开启离心机直到多余的染色液被移除到芯片外，取出PCR反应芯片加检测盖，将芯片置于紫外光或荧光下检测，记录各级别中每个级别的阳性孔的数量；第四步，读取每级反应槽中呈阳性的单体反应槽的个数，其中第i级反应槽中呈阳性的单体反应槽的个数为ai，i＝1,2,3,…,I；I≥2，ai≥1；利用(式1)计算待测样品中被测物质的含量C：其中：vi为第i级反应槽的单体反应槽的体积；ni为第i级反应槽的单体反应槽的个数。